利用RNA干擾技術(shù)雙通道抑制弓形蟲嘌呤補(bǔ)救合成途徑.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種單細(xì)胞原蟲，能侵犯包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游镉泻思?xì)胞，其感染所致的弓形蟲病是世界范圍的嚴(yán)重機(jī)會(huì)致病性寄生蟲病。我國弓形蟲血清陽性率約為7.88％，但是隨著人們飲食習(xí)慣及行為方式的改變，弓形蟲感染率在我國正呈上升的趨勢(shì)，其感染所帶來的危害正受到越來越多人的關(guān)注。弓形蟲感染也是引起家畜(例如家豬)死亡的常見病因之一，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)減產(chǎn)。因此本病是常見的人獸共患寄生蟲病。目前對(duì)于弓形蟲

2、病的治療仍以磺胺嘧啶(SDZ)和乙胺嘧啶(Pyrimethamine)的聯(lián)合使用作為首要選擇。但這種治療方式存在明顯的局限性，因?yàn)榛前奉愃幬镏荒芤种圃鲋禒顟B(tài)的速殖子，而對(duì)相對(duì)靜止和潛伏狀態(tài)的包囊和緩殖子效果較差。該類藥物還存在一系列毒副反應(yīng)。因此尋求新的藥物治療靶標(biāo)及新的治療手段仍是弓形蟲病防治的當(dāng)務(wù)之急。 RNA干擾是近年興起的一項(xiàng)快速、簡(jiǎn)便、高效地抑制基因表達(dá)的新技術(shù)，已成為基因功能研究、基因治療和尋找藥物靶點(diǎn)的重要工具。該

3、技術(shù)己從線蟲的研究拓展到各種生物。然而，遺憾的是，弓形蟲作為頂復(fù)門重要的模式生物，相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。對(duì)于低等生物，RNA干擾始于長片段dsRNA的降解，直接轉(zhuǎn)染長片段dsRNA就可以特異抑制目的基因的表達(dá)。而對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常采取的策略是直接轉(zhuǎn)染小干擾RNA分子(siRNA)以避免長片段dsRNA在細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的非特異性基因抑制。這兩種分子(長片段dsRNA及siRNA)是否能在弓形蟲體內(nèi)抑制目的基因的表達(dá)、運(yùn)用這兩種基因表達(dá)調(diào)節(jié)工

4、具雙通道抑制弓形蟲嘌呤代謝途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶后是否能有效抑制弓形蟲的增殖，上述問題是本研究擬解決的關(guān)鍵問題。 本研究以嘌呤補(bǔ)救合成途徑中的關(guān)鍵酶一AK和HXGPRT編碼基因?yàn)榘袠?biāo)，采用體外轉(zhuǎn)錄長片斷dsRNA及化學(xué)合成siRNA兩種不同的分子分別轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子。根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果，闡明長片斷dsRNA及siRNA對(duì)弓形蟲體內(nèi)基因表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上，雙通道下調(diào)弓形蟲嘌呤代謝途徑中這兩個(gè)關(guān)鍵酶，觀察對(duì)蟲體增殖的抑制情況及其在小

5、鼠體內(nèi)的毒力改變情況，進(jìn)一步探討在弓形蟲感染中其作為治療工具的可能性，為開發(fā)新的抗弓形蟲藥物及新的治療方法奠定基礎(chǔ)。 1.長片斷dsRNA在弓形蟲體內(nèi)對(duì)目的基因的抑制在電轉(zhuǎn)后24h，檢測(cè)到4μg.AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AK mRNA水平明顯降低(P<0.05)，相對(duì)表達(dá)值為0.34±0.13。而8μg及12μg AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AKmRNA的相對(duì)表達(dá)值分別為0.97±0.25，1.15±0.02，與模擬電轉(zhuǎn)

6、弓形蟲相比差異沒有顯著性(P>0.05)。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，4μg AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲AK酶活性在轉(zhuǎn)染后24h開始降低，但與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比差異沒有顯著性。在轉(zhuǎn)染后48h，AK酶活性為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.56±0.15倍(P<0.05)。其他兩個(gè)劑量組沒有檢測(cè)到顯著降低的AK酶活性。 HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)后對(duì)HXGPRT mRNA水平影響的規(guī)律與AK dsRNA對(duì)相應(yīng)mRNA的影響相似。轉(zhuǎn)染后24h，4μg

7、HXGPRT dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)HXGPRT mRNA的相對(duì)表達(dá)值為0.33±0.16，與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比差異有顯著性(P<0.05)。而8μg及12μg HXGPRT dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)HXGPRT mRNA的相對(duì)表達(dá)值分別為0.80±0.19，0.90±0.27，與校準(zhǔn)樣本相比差異沒有顯著性。HXGPRT酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48h，4μg HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)弓形蟲[3H]一次黃嘌呤攝入量與模擬電轉(zhuǎn)弓形

8、蟲相比明顯降低(P<0.05)，酶活性相對(duì)值為0.59±0.02。而8μg和12μg HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)弓形蟲的HXGPRT酶活性沒有發(fā)生明顯降低(P>0.05)。LacZ dsRNA轉(zhuǎn)染不能降低弓形蟲體內(nèi)AK與HXGPRT的mRNA水平及酶活性。 2.長片斷dsRNA雙通道抑制AK及HXGPRT對(duì)弓形蟲增殖速率的影響在感染宿主細(xì)胞后24h、30h及42h，AK及HXGPRT長片段dsRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲的平均倍增次數(shù)

9、分別為1.85±0.97，2.62±1.00，4.27±1.07，與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組的平均倍增次數(shù)相比均明顯減少(P<0.05)。這表明dsRNA聯(lián)合干擾弓形蟲后，其增殖速率明顯放慢。在感染后24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示dsRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲組的感染率為29％，而模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組的感染率為40％。 3.siRNA在弓形蟲體內(nèi)對(duì)目的基因的抑制在針對(duì)AK編碼基因設(shè)計(jì)的三對(duì)25nt的siRNA中，有兩對(duì)(siRNA786,siRN

10、A1200)能明顯降低AKmRNA水平及酶活性，且抑制效率呈劑量依賴性。在感染后24h，21aM及41aM siRNA786電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA有明顯降低(P<0.05)，其相對(duì)值分別為0.59±0.08，0.47±0.13，而1μM siRNA786電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比沒有明顯降低。4μMsiRNA1200電轉(zhuǎn)弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA水平為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.52±0.19倍(P<0.05

11、)。AK酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在感染后24h，2μM及4μM電轉(zhuǎn)弓形蟲的[3H]-腺苷攝入與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組相比有明顯降低(P<0.05)，酶活性相對(duì)值分別為0.45±0.19，0.39±0.11。而4μM siRNA1200電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AK酶活性與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比也有明顯降低(P<0.05)。 在針對(duì)HXGPRT編碼基因設(shè)計(jì)的三對(duì)21nt的siRNA中，只有一對(duì)(siRNA415)能明顯降低HXGPRT mRNA水平及酶活

12、性。在轉(zhuǎn)染后24h，4μM siRNA415電轉(zhuǎn)弓形蟲的HXGPRT mRNA水平及[3H]一次黃嘌呤攝入量分別降為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。 4.siRNA雙通道抑制AK與HXGPRT對(duì)弓形蟲增殖及感染能力的影響在感染宿主細(xì)胞后24h，4gM的siRNA786和siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲、磺胺嘧啶處理弓形蟲及模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的平均倍增次數(shù)分別為：1.64±0.95、1.04±0.88及

13、2.32±0.90，前兩組與后者相比倍增次數(shù)明顯減少(P<0.05)。在感染后40h，siRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲及磺胺嘧啶處理弓形蟲的平均倍增次數(shù)分別為3.00±1.04，2.56±1.04，與模擬電轉(zhuǎn)染組相比(3.60±0.80)差異有顯著性(P<0.05)。 為進(jìn)一步探討弓形蟲AK及HXGPRT被同時(shí)抑制后在小鼠體內(nèi)的毒力，將28只小鼠隨機(jī)分成4組，每組7只。模擬電轉(zhuǎn)組：模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲感染小鼠；SDZ處理組：模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲感染

14、小鼠后連續(xù)7天SDZ灌胃(200mg/kg/d)；siRNA處理組：小鼠感染siRNA786及siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲；SDZ&siRNA聯(lián)合干預(yù)組： siRNA786及siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲感染小鼠后連續(xù)7天SDZ灌胃(200mg/kg/d)。結(jié)果表明，在20天的觀察時(shí)間內(nèi)，模擬電轉(zhuǎn)組、SDZ處理組、siRNA處理組及SDZ&siRNA聯(lián)合干預(yù)組小鼠的平均存活天數(shù)分別為：7.14±0.37，8.85±1.34， 8.14

15、±1.34，10.83±4.67天，與前者相比，SDZ處理組及siRNA處理組小鼠的存活天數(shù)雖然有所延長但差異沒有顯著性，而SDZ&siRNA聯(lián)合干預(yù)組小鼠的存活天數(shù)差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： (1)體外轉(zhuǎn)錄長鏈dsRNA在弓形蟲體內(nèi)能抑制目的基因的表達(dá)； (2)25nt及21nt的siRNA在弓形蟲體內(nèi)能特異性抑制目的基因的表達(dá)； (3)弓形蟲嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶--AK和HXGPRT被體外