通過Epi-LASIK與LASEK術(shù)的實驗研究探討術(shù)后haze形成的機制.pdf

1、第一部分 KM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型微型角膜上皮刀法與乙醇法制作的兔角膜上皮瓣的組織病理學(xué)比較 目的：探討 KM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型微型角膜上皮刀法制作兔角膜上皮瓣的安全性與穩(wěn)定性，并與乙醇法制作的角膜上皮瓣作組織病理學(xué)上的比較，為進一步實驗打下基礎(chǔ)。 方法：11只(22眼)新西蘭大白兔，隨機編號。其中10只(20眼)隨機一眼用KM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型角膜上皮刀作角膜上皮瓣，另一眼行乙醇法(20％乙醇35秒)

2、作角膜上皮瓣，觀察運刀情況及制瓣情況，并作光鏡(PAS染色)和透射電鏡觀察。 結(jié)果：KM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型微型角膜上皮刀運刀均流暢，上皮瓣均貼附良好，瓣緣光滑，其中l(wèi)眼為游離瓣，無破碎瓣，PAS染色法示上皮瓣不包含任何基質(zhì)組織，基底膜完整連續(xù)，基底細胞連接緊密，電鏡觀察示基底膜包括完整的致密層，透明層與半橋粒結(jié)構(gòu)，基底細胞微超結(jié)構(gòu)正常。乙醇法制作的角膜上皮瓣瓣緣不整齊，有2眼瓣破損，PAS染色法示上皮瓣基底膜不連續(xù)、斷裂與

3、缺乏，基底細胞間隙增大，甚至離斷，電鏡示基底細胞內(nèi)空泡增多，細胞間間隙增大，基底膜不完整，無透明層與致密層。 結(jié)論：KM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型微型角膜上皮刀制作兔角膜上皮瓣安全、有效和簡易。該型角膜上皮刀制作的角膜上皮瓣包括完整基底膜，基底細胞形態(tài)連接正常，而乙醇法制作的角膜上皮瓣基底膜不完整，分離平面位于基底膜和基底細胞之間，基底細胞間連接松散。ICM-5000DE自動旋轉(zhuǎn)型微型角膜上皮刀適合用來作微型角膜刀法上皮瓣下準分子

4、激光磨鑲術(shù)(Epi-LASIK)的動物實驗。 第二部分 Epi-LASIK與LASEK術(shù)后角膜創(chuàng)傷愈合對比的實驗研究 目的：比較Epi-LASIK與LASEK術(shù)后角膜創(chuàng)傷愈合情況，在組織與分子病理學(xué)上探討角膜上皮下霧狀混濁(haze)的差別與成因。 方法：50只新西蘭大白兔隨機編號，其中48只(96眼)隨機一眼行Epi-LASIK，另眼行LASEK，余2只(4眼)未手術(shù)眼作為對照組。采用裂隙燈顯微鏡下觀察haze

5、l情況；透射電鏡觀察角膜基質(zhì)細胞形態(tài)的改變；TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)觀察角膜基質(zhì)細胞的凋亡情況；Ki-67、α-SMA、Ⅲ型膠原和TGF-β1的免疫組化，免疫印跡法測定角膜組織α-SMA和Ⅲ型膠原蛋白和實時熒光定量PCR測定TGF-β1mRNA的表達，來觀察角膜基質(zhì)細胞的增殖與向肌成纖維母細胞轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)(Ⅲ型膠原)和TGF-β1的表達情況，作計數(shù)與半定量分析，進行對haze形成影響的分析。 結(jié)果：裂

6、隙燈顯微鏡下示LASEK術(shù)后1月與3月haze均較同期Epi-LASIK術(shù)后明顯。透射電鏡檢查示LASEK術(shù)后早期更易發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，與同期Epi-LASIK相比，細胞器代謝更活躍及膠原排列更紊亂。Epi-LASIK與LASEK術(shù)后早期角膜基質(zhì)中均有較多的TUNEL陽性細胞出現(xiàn)，在術(shù)后24小時達到最高峰，LASEK術(shù)后1周內(nèi)較Epi-LASIK有明顯的細胞凋亡情況(P<0.01)?；|(zhì)Ki-67陽性細胞術(shù)后l周內(nèi)均有增高的表達，72小時時

7、表達最高，兩組在1周內(nèi)差異有顯著性(P<0.01)。α-SMA陽性細胞在術(shù)后1周開始明顯出現(xiàn)，3月時仍有較高表達，在術(shù)后1月時陽性細胞數(shù)達到最高，α-SMA蛋白表達量的情況與α-SMA陽性細胞數(shù)變化一致，LASEK術(shù)后增高的情況較同期Epi—LASIK差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ⅲ型膠原免疫組化及免疫印跡法示LASEK術(shù)后1周、1月和3月的表達均較同期Epi-LASIK術(shù)后為高(P<0.01)，最高峰均在術(shù)后1月；TGF-β1免疫

8、組化及mRNA實時熒光定量PCR測定有類似變化，TGF-β1mRNA二種術(shù)式同期間差異明顯(P<0.01)。 結(jié)論：Epi-LASIK較LASEK有著更輕的角膜基質(zhì)細胞凋亡、更弱的增殖以及向肌成纖維母細胞的轉(zhuǎn)化，并有著更少的細胞外基質(zhì)(Ⅲ型膠原)和TGF-β1的生成，提示著Epi-LASIK較LASEK有著更輕haze反應(yīng)幾率。完整角膜上皮層的維持有利于減少術(shù)后haze的形成。 第三部分 微型角膜刀法與乙醇法制作的離體

9、兔角膜上皮瓣對培養(yǎng)角膜基質(zhì)細胞影響的實驗研究 目的：通過比較微型角膜刀法與乙醇法制作的離體兔角膜上皮瓣對培養(yǎng)角膜基質(zhì)細胞增殖與轉(zhuǎn)化的影響，探討角膜上皮的完整性在減輕haze形成中的作用。 方法：酶消化法分離培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞，分為空白對照(1％serum DMEM)、陽性對照(1ng/ml TGF-β1)、微型角膜刀法角膜上皮瓣共培養(yǎng)(Epi-LASIK法)、乙醇法角膜上皮瓣共培養(yǎng)(LASEK法)及該二組共培養(yǎng)分別加TG

10、F-β1抗體6組。相差顯微鏡下觀察角膜基質(zhì)細胞形態(tài)的改變，Ki-67免疫組化觀察角膜基質(zhì)細胞增殖、和α-SMA免疫組化及免疫印跡法觀察向肌成纖維母細胞轉(zhuǎn)化情況。 結(jié)果：培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細胞早期表現(xiàn)為胞體與突起細長，隨著時間延長，胞體與突起增大，胞漿豐富，這在LASEK法與Epi-LASIK法共培養(yǎng)組更為明顯。共培養(yǎng)3天后Ki-67免疫組化陽性細胞計數(shù)示Epi-LASIK和LASEK法共培養(yǎng)組較空白對照組高，有統(tǒng)計學(xué)上差異(P<0.

11、01)，但二者間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，Epi-LASIK和LASEK法共培養(yǎng)組與相應(yīng)的加TGF-β1抗體組均有統(tǒng)計學(xué)上差異(P<0.05)，但加TGF-β1抗體組均與空白對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。共培養(yǎng)5天后α-SMA免疫組化示Epi-LASIK法和LASEK法組均較相應(yīng)加 TGF-β1抗體組和空白對照組的細胞更為粗大，熒光強度高，進一步的免疫印跡法示α-SMA蛋白表達在Epi-LASIK法和LASEK法組共培養(yǎng)組間