RNAi剔降人蛋白激酶CK2α亞基的表達(dá)及其對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長增殖影響的研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文RNAi剔降人蛋白激酶CK2α亞基的表達(dá)及其對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長增殖影響的研究姓名：朱汝森申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：梁念慈;劉新光20050501R N A i 剔降人蛋白激酶C K 2 僅亞基的表達(dá)及其對人乳腺癌細(xì)胞M C F ．7 生長增殖影響的研究中文摘要目的：以R N A 干擾( R N A i ) 技術(shù)剔降人蛋白激酶C K 2 a 亞基的表達(dá)，觀察其對人乳腺癌細(xì)胞生長增

2、殖抑制的效果，探討腫瘤新的治療策略。方法：根據(jù)久C K 2 a 基因序列及二級結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)T u s c h l 等設(shè)計s h R N A的原則，確定C K 2 a 基因的干擾位點，以m U 6 p r o v e c t o r 質(zhì)粒為載體，以定向克隆的方法構(gòu)建針對人蛋白激酶C K 2 c t 亞基的重組s h R N A 表達(dá)質(zhì)粒：電泳法初步篩選正確的重組克??；D N A 測序驗證重組克隆插入序列的正確性：通過將重組質(zhì)粒與綠色熒光

3、蛋白表達(dá)質(zhì)粒p E G F P - N 1 在脂質(zhì)體L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染的方法，熒光顯微觀察轉(zhuǎn)染效果；M T T 法觀察R N A i 作用對人乳腺癌細(xì)胞M C F ．7 生長增殖的影響，并篩選最有效的R N A i 作用位點；R T - P C R 檢測R N A i對腫瘤細(xì)胞內(nèi)C K 2 各亞基m R N A 水平的影響：同位素參入法檢測R N A i 對腫瘤細(xì)胞內(nèi)C

4、 K 2 活性的影響：H o e c h s t 熒光染色觀察R N A i 作用后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變：流式細(xì)胞術(shù)檢鋇4R N A i 對腫瘤細(xì)胞周期的影響及凋亡情況；M T T 法及流式細(xì)胞術(shù)檢測R N A i 對腫瘤化療藥物紫杉醇抗癌作用的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建了候選的針對人蛋白激酶C K 2 c t 亞基的s h R N A 表達(dá)質(zhì)粒，針對A 、B 和D 位點的克隆能夠正確測序，并且測序結(jié)果證實了插入的轉(zhuǎn)錄模板序列完全正確，而針對

5、C 位點的克隆不能正常測序；脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組s h R N A表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比較高；與未處理組比較，針對B 位點的R N A i 作用對M C F 一7 細(xì)胞的存活率無明顯影響( P > O ．0 5 ) ，而針對A 、c 和D 位點的R N A i 作用可明顯降低M C F 一7 細(xì)胞的存活率( J D < O ．0 1 ) ，其中針對位點D 的抑制效果最強；R N A i 可使C K 2 c t 的m R N A 水