淫羊藿黃酮類成分在健康及骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下大鼠腸道吸收代謝差異研究.pdf

1、制劑處方前研究藥物的吸收代謝等生物藥劑學(xué)性質(zhì)對于預(yù)測藥物在體內(nèi)的動態(tài)吸收過程起著關(guān)鍵的指導(dǎo)作用。淫羊藿黃酮具有很好的抗骨質(zhì)疏松活性，本課題組前期研究表明:淫羊藿黃酮的吸收滲透系數(shù)較小，腸道吸收都較差，口服直接以原型的形式吸收很少，在腸道中主要被腸道菌和腸道酶水解為次級苷而易于吸收。但目前研究多以健康大鼠為研究對象，而在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下淫羊藿黃酮的生物藥劑學(xué)性質(zhì)是否發(fā)生了變化，腸吸收特性、代謝途徑等生物藥劑學(xué)特性是否與健康狀態(tài)下的結(jié)果一

2、致卻未見文獻(xiàn)報道。文獻(xiàn)報道機(jī)體對藥物的處置過程在病理狀態(tài)下可能會改變，進(jìn)而藥物的療效和不良反應(yīng)也受到影響，而病理狀態(tài)下研究藥物的生物藥劑學(xué)特性能夠更好的模擬臨床，更真實(shí)的反應(yīng)在疾病狀態(tài)下藥物的吸收情況，更能呈現(xiàn)生物利用度的問題。因此，本文旨在研究骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下的淫羊藿黃酮腸道吸收代謝特性，比較其與健康狀態(tài)下的差異，為將其研究成高效的抗骨質(zhì)疏松藥物制劑提供生物藥劑學(xué)研究基礎(chǔ)。
　　本文采用體外腸道菌和腸黏膜孵育以及在體大鼠腸灌流

3、多種方法，比較了淫羊藿黃酮在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)和健康狀態(tài)大鼠腸道吸收代謝的差異。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.離體大鼠腸道菌、腸黏膜孵育樣品及大鼠腸灌流樣品分析方法學(xué)的建立建立了淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I腸菌孵育和腸黏膜孵育樣品的高效液相分析方法，以及淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C大鼠腸灌流樣品的超高效液相分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所建方法準(zhǔn)確、可靠。
　　2.淫羊藿黃酮在健康及骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下大鼠腸

4、道菌和腸黏膜中的代謝差異研究
　　采用離體大鼠腸菌和腸黏膜孵育法，考察比較了在健康和骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下淫羊藿黃酮的代謝差異性。結(jié)果均表明:骨質(zhì)疏松病理組大鼠對淫羊藿黃酮類化合物的代謝作用明顯減弱，淫羊藿黃酮在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下的代謝速率比健康狀態(tài)下慢。
　　在用離體大鼠腸菌孵育淫羊藿黃酮時，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在健康組孵育1h后分別代謝了65％、63％、59％、51％，而在病理組孵育1h后分別只代謝了46％

5、、37％、40％、37％，且實(shí)驗(yàn)以淫羊藿黃酮每個時間點(diǎn)的對數(shù)濃度和時間做線性回歸方程，斜率的絕對值越大代表代謝速率越快，結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)病理狀態(tài)下腸菌孵育時，淫羊藿黃酮類化合物的代謝速率明顯降低。不論是健康狀態(tài)還是骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下，淫羊藿黃酮的代謝途徑?jīng)]有變化，均為在腸道菌群的作用下脫掉C-7位的糖基代謝為相應(yīng)的次級苷，經(jīng)UPLC/Q-TOF-MS鑒定相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的代謝產(chǎn)物分別為寶藿苷I、箭藿苷

6、A、箭藿苷B、2"-O-rhamnosylicarisideⅡ。寶藿苷I經(jīng)腸菌孵育時，在健康和病理狀態(tài)下均未發(fā)生代謝。
　　離體大鼠腸黏膜孵育淫羊藿黃酮時，分別刮取大鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸段黏膜與藥物進(jìn)行孵育。不論是在健康狀態(tài)還是病理狀態(tài)，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C主要是被大鼠十二指腸和空腸段的腸道酶水解。孵育1h后，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組十二指腸段分別剩余約32％、85％、78％、68

7、％未發(fā)生代謝，是健康組十二指腸段孵育相同時間后各化合物剩余含量的大約2.90倍、1.39倍、1.12倍、1.84倍;在空腸段孵育1h后，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分別剩余約28％、76％、91％、77％未發(fā)生代謝，是健康組空腸段孵育相同時間后各化合物剩余含量的大約1.87倍、1.13倍、1.10倍、2.56倍。孵育1h后，各化合物在病理組回腸段和結(jié)腸段幾乎未發(fā)生代謝。對于寶藿苷I，在健康組及骨質(zhì)疏松病理組腸黏膜孵育時，在各腸

8、段均未發(fā)生代謝，沒有代謝產(chǎn)物的生成。經(jīng)腸黏膜孵育后，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的代謝產(chǎn)物與腸菌孵育時一致，淫羊藿苷略有不同，淫羊藿苷的主要代謝產(chǎn)物為脫掉C-7位的葡萄糖基后生成的寶藿苷I，另一個代謝產(chǎn)物推測可能是淫羊藿苷的重排產(chǎn)物，具體結(jié)構(gòu)還需要做1HNMR，13CNMR等加以判斷。
　　3.實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸灌流法，研究比較了淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在健康和骨質(zhì)疏松狀態(tài)下在體腸吸收特性的差異
　　結(jié)果顯示:

9、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組大鼠各腸段的滲透系數(shù)和消除百分率與健康組相比，均明顯地減小。這幾個化合物在大鼠不同腸段的吸收存在差異，其中十二指腸和空腸腸壁滲透系數(shù)顯著高于回腸段和結(jié)腸段。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在病理組大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的表觀滲透系數(shù)（P*eff值）比健康組各腸段的P*eff值分別減少了約29％～44％、32％～50％、40％～56％、27％～53％;在病理組大鼠十二指腸、空腸、

10、回腸、結(jié)腸的消除百分率也比健康組顯著地減少，減少的比例幾乎與P*eff值的減少比例大體一致。UPLC/Q-TOF-MS鑒定結(jié)果得知，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C腸灌流后的代謝產(chǎn)物與腸菌孵育一致，淫羊藿苷經(jīng)大鼠腸灌流后的代謝產(chǎn)物與腸黏膜孵育的代謝產(chǎn)物一致。
　　4.采用Caco-2細(xì)胞模型研究了朝藿定A/B/C的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
　　課題組前期系統(tǒng)研究了淫羊藿苷和寶藿苷I的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性，并未對朝藿定A/B/C做深入的研究，因此，本

11、課題在前期研究的基礎(chǔ)上，又對朝藿定A/B/C的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制做了深入的研究。實(shí)驗(yàn)考察了維拉帕米、MK571和潘生丁三種不同的抑制劑對朝藿定A/B/C轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果顯示，加入BCRP的抑制劑（潘生?。r，朝藿定A/B/C從頂端側(cè)到基底側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯增加而基底側(cè)到頂端側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)顯著被抑制。加入P-gp的抑制劑（維拉帕米）時，只有朝藿定A/C有上述結(jié)果。這三個化合物吸收滲透系數(shù)和分泌滲透系數(shù)的顯著性差異說明P-gp和BCRP可能參與了朝藿定A/C

12、的轉(zhuǎn)運(yùn)而朝藿定B的轉(zhuǎn)運(yùn)可能只有BCRP的參與。由此說明，腸吸收滲透性差和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P-gp和BCRP)的參與可能是導(dǎo)致異戊烯基黃酮生物利用度差的主要原因。
　　綜上所述，不論是在離體還是在體的情況下，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下的吸收代謝與健康組相比均有顯著性的差異。在骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)下，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C體外代謝速率，在體腸吸收滲透系數(shù)以及消除百分率均比健康組明顯降低。推測出