胃癌人源性ScFv噬菌體單鏈體庫的構(gòu)建和初步鑒定.pdf

1、背景:
　　 胃癌(Gastric Cancer)是全球常見腫瘤,全世界每年約有93.4萬胃癌新發(fā)病例,有70萬人死于胃癌,發(fā)病率居常見腫瘤第四位。在我國,胃癌死亡率占所有惡性腫瘤死亡率的23.02％,居各類癌癥死亡率首位?，F(xiàn)階段,胃癌的診斷方法以X線和內(nèi)鏡超聲等為主,這對胃癌的早期診斷尚缺乏足夠的準確性和特異性,在治療方面,以放療、化療和手術(shù)治療為主的綜合治療也因其副作用太大使其在臨床中的應(yīng)用受到了很多限制。所以,許多研究者把

2、研究熱點轉(zhuǎn)向了胃癌的抗體診斷和治療,這對胃癌的防治將具有重要的意義。
　　 抗體技術(shù)的應(yīng)用對醫(yī)學(xué)發(fā)展起了非常重要的推動作用,被廣泛地應(yīng)用于實驗室研究、疾病的診斷和治療,其在疾病診斷、治療和預(yù)防等方面顯示出了重要作用。噬菌體抗體庫(Phage Antibody Library)的構(gòu)建以聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)和噬菌體展示(Phage Display Techniques,PDT)技

3、術(shù)為基礎(chǔ),通過構(gòu)建人源性單鏈噬菌體抗體庫為獲得特異性抗體分子提供有效途徑。這不僅是一種制備人源性抗體的有效方法,而且能夠制備出具有大容量和多樣性較好的抗體庫,在獲得高親和力的抗體以及在對抗體性能進行改造方面具有強大的優(yōu)勢。噬菌體抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使研究者能夠在體外模擬體內(nèi)B細胞產(chǎn)生抗體的整個過程,為人源抗體的制備提供了簡便而高效的可操作系統(tǒng),因而在多種疾病的預(yù)防、診斷和治療方面均具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　 目的:

4、r>　　 利用基因工程方法和噬菌體抗體庫這一新興的生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建胃癌人源性ScFv噬菌體單鏈抗體庫,并初步鑒定其生物學(xué)特性,為胃癌的免疫診斷和免疫治療提供新載體。
　　 方法：
　　 1.取原發(fā)性胃癌患者癌周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)作為B細胞的來源,提取淋巴細胞的總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)擴增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體輕

5、鏈可變區(qū)(VL)基因片段,對Vn、VL基因片段分別進行酶切和凝膠回收純化；合成Linker連接肽,連接VL+Linker,再連Vn形成VH-Linker-VL,然后,在抗體基因片段的兩端引入酶切位點SfiⅠ和NotⅠ,最后利用“重疊延伸拼接PCR(Splicing by Overlap Extension Polymerase ChainReaction,SOE-PCR)”技術(shù)將其拼接成完整的單鏈抗體(ScFv)基因片段。
　　

6、 2.噬菌體單鏈抗體(ScFv)與載體pCANTAB-5E拼接,構(gòu)建抗體庫:單鏈抗體ScFv基因片段用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ,NotⅠ分步酶切后,凝膠回收純化酶切產(chǎn)物并通過連接反應(yīng)將單鏈抗體ScFv與載體pCANTAB-5E連接,制備轉(zhuǎn)化效率達到6.0×107cfu/ug pUC的高濃度感受態(tài)大腸桿菌TG1,將插入單鏈抗體ScFv的噬菌體載體pCANTAB-5E轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染,噬菌體展示即可制備出

7、單鏈噬菌體ScFv抗體庫,對抗體庫的庫容量與重組率進行檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.結(jié)果顯示:從胃癌癌周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中提取的總RNA在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可見明顯的28S和18S兩條帶,提示RNA的完整性良好；重鏈VH基因片段的大小為375bp,輕鏈VL基因片段的大小為325bp；組裝后的ScFv基因片段(VH-Linker-VL)PCR擴增顯示長度為750bp。
　　 2.獲得4.7x107cfu/ug氨芐青霉

8、素抗性克隆。以適量轉(zhuǎn)化細菌菌液鋪平板,隨機提取10個克隆,小提載體質(zhì)粒DNA后以SfiⅠ和NotⅠ分步酶切鑒定,陽性插入率為80％(8/10)。經(jīng)測序證實抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準確插入了載體,同源性為91％。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗成功構(gòu)建了庫容量為4.7x107cfu/ug的ScFv噬菌體抗體庫,重組率為80％(8/10),重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因序列同源性為91％。結(jié)果表明通過噬菌體抗體庫技術(shù)(Ph