E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜異位癥是好發(fā)于育齡期婦女的一種婦科常見(jiàn)疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為明顯的痛經(jīng)、月經(jīng)增多及不孕等，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量。目前，其發(fā)病機(jī)制仍不明確。子宮內(nèi)膜異位癥的惡變率很低，但是臨床研究顯示，其可以表現(xiàn)出侵襲轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的特性。因此，介導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移的基因可能在其發(fā)病過(guò)程中起到了重要的作用。
　　E-鈣粘蛋白，是一種跨膜糖蛋白，在細(xì)胞間的粘附過(guò)程中起重要作用，其表達(dá)水平的下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞間的粘附能力降低，而細(xì)胞的活動(dòng)性也

2、將隨之增加。在上皮性腫瘤中，E-鈣粘蛋白的表達(dá)下降可以直接促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲?；騿?dòng)子區(qū)的高甲基化是E-鈣粘蛋白下調(diào)甚至失活的重要途徑，在諸多腫瘤組織中都檢測(cè)到其基因CDH1啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，并且mRNA和蛋白的表達(dá)量也會(huì)隨之下降。對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的研究發(fā)現(xiàn)，在E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)的異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞株中檢測(cè)到CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，應(yīng)用曲古抑菌素A（去甲基化藥物）處理后，E-鈣粘蛋白恢復(fù)高表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞的侵襲性減弱。

3、r>　　本研究旨在探討CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用，意義在于從分子機(jī)制上更為深入地探究其發(fā)病機(jī)制，也為臨床上治療該疾病提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1標(biāo)本采集:病例組:2012.8-2013.3在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科就診并行手術(shù)治療的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（卵巢巧克力囊腫）患者的異位內(nèi)膜及其在位內(nèi)膜組織各50例，患者的平均年齡為36.74±6.76歲，術(shù)后病理診斷全部是子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)前

4、從未接受過(guò)激素治療。對(duì)照組:收集在同一家醫(yī)院同期因CINⅢ做全子宮切除術(shù)患者的子宮內(nèi)膜組織50例，患者的平均年齡為43.57±5.02歲，均經(jīng)病理證實(shí)是正常子宮內(nèi)膜組織，無(wú)惡變及子宮內(nèi)膜異位癥。
　　2實(shí)驗(yàn)步驟
　　2.1標(biāo)本處理:病例組與對(duì)照組標(biāo)本離體后，即刻浸泡在事先準(zhǔn)備好的RNA later液中，并馬上轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中過(guò)夜，后放在-20℃冰箱中貯存以備用。
　　2.2 DNA提取:將病例組與對(duì)照組標(biāo)本各取出50-

5、100mg，分別進(jìn)行組織研磨，提取組織DNA。
　　2.3 E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測(cè):利用甲基化特異性PCR技術(shù)(MSP)檢測(cè)所有標(biāo)本的組織DNA中的甲基化情況，分別計(jì)算兩組的甲基化率。
　　2.4 MSP結(jié)果驗(yàn)證:隨機(jī)抽取甲基化陽(yáng)性和陰性樣本，PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，驗(yàn)證MSP結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　2.5 RNA提取:將病例組與對(duì)照組標(biāo)本各取出50-100mg，在冰上研磨，提取組織RNA。
　　2

6、.6 E-鈣粘蛋白基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè):利用RT-PCR方法分別檢測(cè)甲基化陽(yáng)性和甲基化陰性的標(biāo)本中E-鈣粘蛋白基因mRNA的表達(dá)情況。
　　2.7 E-鈣粘蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)甲基化陽(yáng)性和甲基化陰性的標(biāo)本中E-鈣粘蛋白的表達(dá)情況。
　　2.8數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析。
　　結(jié)果:
　　1病例組與對(duì)照組中CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況
　　異位、在位和正常內(nèi)膜組織中，

7、CDH1基因的甲基化率分別是32％(16/50)、26％(13/50)和8％(4/50)。與正常內(nèi)膜組織相比，異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜組織中的甲基化率均明顯升高（x2=9.00，P=0.003;x2=5.74，P=0.017）。在位內(nèi)膜組織與異位內(nèi)膜組織相比，無(wú)明顯差異(x2=0.44，P=0.509)。
　　2甲基化陽(yáng)性和甲基化陰性的組織中CDH1基因mRNA表達(dá)量的比較
　　甲基化陽(yáng)性的組織中，CDH1基因mRNA的平均表達(dá)量

8、為0.41±0.20;甲基化陰性的組織中，CDH1基因mRNA的平均表達(dá)量為0.55±0.07。經(jīng)t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)，甲基化陽(yáng)性組織中mRNA的表達(dá)量明顯低于甲基化陰性組織(t=-2.50，P=0.023)。
　　3甲基化陽(yáng)性和甲基化陰性的組織中E-鈣粘蛋白表達(dá)量的比較
　　甲基化陽(yáng)性組織中，E-鈣粘蛋白的平均表達(dá)率為9.58±8.08％;甲基化陰性的組織中，E-鈣粘蛋白的平均表達(dá)率為18.72±12.70％。經(jīng)t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)，

9、甲基化陽(yáng)性組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)率明顯低于甲基化陰性組織(t=-2.35，P=0.027)。
　　4甲基化陽(yáng)性和甲基化陰性的組織中CDH1基因mRNA表達(dá)量和E-鈣粘蛋白表達(dá)率的相關(guān)性比較
　　經(jīng)Pearson Correlation Coefficients檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)，CDH1基因mRNA的表達(dá)量和其對(duì)應(yīng)的E-鈣粘蛋白的表達(dá)率密切相關(guān)（r=0.43，P=0.017）。
　　結(jié)論:
　　卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者