骨性關節(jié)炎軟骨下骨三維結構和力學性能改變及早期干預的實驗研究.pdf

1、第一部分：骨關節(jié)炎早期軟骨下骨三維結構變化及二磷酸鹽的干預效應
　　目的：觀察兔膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨三維結構變化及二磷酸鹽的干預作用，以探討骨性關節(jié)炎(OA)早期軟骨下骨三維結構的變化在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機數(shù)字表法分為模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對照組（n=12）。采用兔關節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。分三組：二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，

2、Risedronate sodium）0.01mg/kg體重；模型組和對照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術后分別于4W、8W、12 W各時相點分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對照組（n=4）。分別切取保留關節(jié)面上下各2cm骨的手術側膝關節(jié)，清除軟組織，后行Micro-CT檢查。得具體測量參數(shù)：骨體積分數(shù)(BVF),、骨小梁厚度Tb.Th)、骨小梁間隔(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、體積骨密度(vB

3、MD)、組織骨密度（tBMD），并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：模型組、二磷酸鹽組、對照組不同時期的骨密度及軟骨下骨微結構參數(shù)變化。顯示術后第4W三組比較，模型組體積分數(shù)（BVF）、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度（Tb.Th）比對照組明顯降低，P<0.01；體積分數(shù)(BVF)比二磷酸鹽組也降低P<0.05；BVF二磷酸鹽組與對照組比亦降低,P<0.05；骨小梁分離度（Tb.Sp）模型組比二磷酸鹽及對照組均增大,P<0.01。二磷

4、酸鹽組比對照組明顯增大,P<0.01。骨密度模型組比二磷酸鹽及對照組明顯降低,P<0.05。而二磷酸鹽組與對照組無統(tǒng)計學差異,P>0.05。12周時三組比較，模型組體積分數(shù)（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目(Tb.N)比二磷酸鹽及對照組明顯增加,P<0.05。骨小梁分離度明顯減少,P<0.05。而骨密度顯著增加,P<0.01。我們對不同時期相關微結構參數(shù)也進行了比較,統(tǒng)計學分析。4周時和12周時軟骨下骨微結構及骨密度變化情

5、況比較，骨體積分數(shù)，骨小梁厚度，骨小梁數(shù)目明顯增加,P<0.01。骨小梁分離度明顯減小,P<0.01。12周時的骨密度較4周時顯著增加,P<0.01。
　　結論：膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨三維結構發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)明顯的骨重塑。早期以骨破壞為主，各種骨量及骨結構指標均下降。后期出現(xiàn)明顯的骨形成，各種骨量及骨結構指標均增加。二磷酸鹽可通過抗骨吸收明顯抑制軟骨下骨的骨重塑，緩解骨質破壞和吸收，保護軟骨下骨的骨結構，進而保護軟骨下骨的力學性

6、能，從而保護關節(jié)軟骨。軟骨下骨三維結構的改變在OA發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　第二部分：骨關節(jié)炎軟骨下骨力學性能變化有限元分析及二磷酸鹽的干預效應
　　目的：觀察兔膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨力學性能的改變及二磷酸鹽的干預作用，以探討骨性關節(jié)炎(OA)早期軟骨下骨力學性能的改變在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機數(shù)字表法60只新西蘭大白兔隨機分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24

7、）,對照組（n=12）。采用兔關節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉， Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術后分別于4W、8W、12W各時相點分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對照組（n=4）。分別切取保留關節(jié)面上下各2cm骨的手術側膝關節(jié)，清除軟組織，進行大體評分。后行Micro-CT檢查。從

8、Micro-CT得到DICOM式的二維圖像文件。將獲得的DICOM導入Mimics V10.01軟件中進行擬合，并導入到Ansys V10中進行有限元處理。得到關節(jié)軟骨組織損傷Mankin評分；通過Micro-CT對60個標本進行檢查，得到體積分數(shù)（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨密度（BMD）有限元軟件計算得到彈性模量(EM)，反應力(RF)，平均Von Mises應力。后進行統(tǒng)

9、計學分析比較。
　　結果：兔膝關節(jié)不穩(wěn)造模術后4W時，模型組、二磷酸鹽組、對照組三組比較體積分數(shù)、彈性模量、反應力、平均Von Mises應力參數(shù)均下降，模型組比二磷酸鹽組、對照組低, P<0.01。二磷酸鹽組與對照組也下降，但P>0.05。骨密度模型組比二磷酸鹽及對照組明顯降低，而二磷酸鹽組與對照組無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。12W時模型組體積分數(shù)（BVF）、骨密度（BMD）明顯增加, P<0.01。彈性模量、反應力， Von

10、 Mises應力較對照組和二磷酸鹽組低;二磷酸鹽組亦較對照組低，但無統(tǒng)計意義， P>0.05。4W與12W時，BVF、BMD、彈性模量、反應力，Von Mises應力均升高P>0.01。并進行相關性比較，結果顯示術后4周，彈性模量與Mankin評分相關系數(shù)r=―0.835，（P<0.01）,有顯著相關性，呈負相關。與骨密度相關系數(shù)r=0.848，（P<0.01）有顯著相關性，呈正相關。與體積分數(shù)相關系數(shù)r=0.893，（P<0.01）,

11、有顯著相關性，呈正相關。12W時，彈性模量與Mankin評分相關系數(shù)r=―0.883，（P<0.01）,有顯著相關性，呈負相關。與骨密度相關系數(shù) r=0.861，（P<0.01），有顯著相關性，呈正相關；彈性模量與體積分數(shù)相關系數(shù)r=0.817，（P<0.01）,有顯著相關性，呈正相關。
　　結論：膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨發(fā)生力學性能改變，早期彈性模量明顯降低，后期升高。同時彈性模量和軟骨下骨的 BMD、體積分數(shù)及關節(jié)軟骨的 Man

12、kin評分密切相關。二磷酸鹽可通過抗骨吸收明顯提高軟骨下骨的彈性模量，表明關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨力學性能的改變可能和異常應力引起的骨吸收有關。軟骨下骨力學性能的改變在OA發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　第三部分：兔膝骨關節(jié)炎早期軟骨下骨血管再生變化及二磷酸鹽干預效應的實驗研究
　　目的：觀察兔膝關節(jié)不穩(wěn)早期關節(jié)軟骨改變和軟骨下骨血管再生變化以及二磷酸鹽的保護作用，探討OA早期關節(jié)軟骨改變和軟骨下骨血管再生變化之間的關系以及軟骨下

13、骨在OA中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機數(shù)字表法60只新西蘭大白兔隨機分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對照組（n=12）。采用兔關節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術后分別于4W、8W、12W各時相點分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8

14、），二磷酸鹽組（n=8）,對照組（n=4）。分別切取保留關節(jié)面上下各2cm骨的手術側膝關節(jié)，清除軟組織，進行大體評分。通過對關節(jié)軟骨表面形態(tài)觀察及 HE染色觀察,進行關節(jié)軟骨損傷Mankin評分。同時對軟骨下骨骨軟骨連接處的血管密度進行計數(shù)。通過計算穿過骨軟骨連接處的血管數(shù)目來確定血管密度，亦即接觸或穿過潮線的血管數(shù)目。并進行統(tǒng)計學比較。
　　結果：4W時模型組出現(xiàn)2例出現(xiàn)關節(jié)積液和滑膜增生，關節(jié)面糜爛、粗糙；8w時2例出現(xiàn)積液及

15、滑膜增生，滑液輕度混濁，軟骨改變集中在股骨內髁關節(jié)面，軟骨軟化，關節(jié)面發(fā)黃纖維化明顯，有大的縫隙出現(xiàn)；12w時滑膜結節(jié)樣增生，滑液混濁，有2例股骨內髁關節(jié)面出現(xiàn)了大的裂縫和潰瘍，并且見到骨贅。統(tǒng)計學分析結果顯示統(tǒng)計學分析結果顯示4w時模型組與二磷酸鹽組、對照組比較，已出現(xiàn)軟骨退變（P<0.01），8、12w時退變進一步加重（P<0.01）。而12w退變明顯比4W時嚴重，（P<0.01）。對照側多為正常關節(jié)軟骨表現(xiàn)，Mainkin評分0-

16、1分。HE染色顯示，模型組和二磷酸鹽組關節(jié)軟骨損傷Mankin評分在兔膝關節(jié)不穩(wěn)4w時模型組與二磷酸鹽組、對照組比較，已出現(xiàn)軟骨退變（P<0.01），8、12w時退變進一步加重（P<0.01）。而12w退變明顯比4w時嚴重，（P<0.01）。顯示，股骨內外髁骨軟骨交界區(qū)的血管侵犯在OA早期與對照組相比明顯增加（P<0.01）,8w、12w和4w有明顯差別（P<0.01），股骨外髁8w時明顯增加（P<0.01），股骨內髁比股骨外髁在每個時

17、間點有明顯增多（P<0.01）。對股骨內外髁不同組之間的骨軟骨連接區(qū)的血管侵犯的密度也進行了比較，結果顯示，模型組與對照組有統(tǒng)計學意義（P<0.01），模型組與用藥組明顯差別(P<0.01）。
　　結論：膝關節(jié)不穩(wěn)早期關節(jié)軟骨開始退變，軟骨下骨與關節(jié)軟骨交界區(qū)血管增生。二磷酸鹽對關節(jié)軟骨有明顯的保護作用，其作用機制可能與其抑制血管增生，抗骨吸收改善關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨的力學性能有關。關節(jié)軟骨和軟骨下骨是一個相互聯(lián)系的統(tǒng)一體，軟骨下

18、骨在OA的發(fā)病中可能有著更為重要的作用。
　　第四部分：兔骨關節(jié)炎模型早期關節(jié)軟骨及軟骨下骨生化改變及二磷酸鹽的干預效應
　　目的：觀察兔膝關節(jié)不穩(wěn)早期關節(jié)軟骨基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）、軟骨下骨基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和組織蛋白酶K(CK)的表達變化及二磷酸鹽的抑制作用，進一步證明OA早期軟骨下骨存在骨吸收，并探討其機制及其二磷酸鹽的作用途徑。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機數(shù)字表法60

19、只新西蘭大白兔隨機分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對照組（n=12）。采用兔關節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉， Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術后分別于4W、8W、12W各時相點分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對照組（n=4）。在各個時相點模型組和二磷酸鹽組各取

20、8個右膝關節(jié)，對照組取4個右膝關節(jié)的股骨內側髁，用SP免疫組化染色方法分別檢測各組在4W和12W時關節(jié)軟骨MMP-13、軟骨下骨MMP-9和CK表達變化，并進行統(tǒng)計學比較分析。
　　結果：兔膝關節(jié)不穩(wěn)造模4W時各組都有MMP-13、MMP-9和CK陽性表達細胞。對照組和二磷酸鹽組陽性細胞較少，模型組陽性細胞較多。對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽性表達率分別為4.17%、10%和95%；對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽

21、性表達率分別為4%、12.5%和90%；CK陽性表達率分別為8.33%、12.5%和90%。與對照組比較，模型組有顯著性差異(P<0.01)，而二磷酸鹽組無顯著性差異(P>0.05)。二磷酸鹽能明顯減少MMP-13、MMP-9和CK陽性表達；與模型組比較，有顯著性差異(P<0.01)。兔膝關節(jié)不穩(wěn)造模8W時各組都有MMP-13、MMP-9和CK陽性表性差異滬>0.05 )。二磷酸鹽能明顯減少MMP-13, MMP-9和CK陽性表達細胞。

22、對照組和二磷酸鹽組陽性細胞較少，模型組陽性細胞較多。對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽性表達率分別為8.33% , 12.5%和95%，對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽性表達率分別為8.33% , 12.5%和87.5%；CK陽性表達率分別為8.33%,12.5%和85%。與對照組比較，模型組有顯著性差異(P<0.01),而二磷酸鹽組無顯著性差異((P>0.05)。二磷酸鹽能明顯減少MMP-13, MMP-9和CK陽性表達

23、;與模型組比較，有顯著性差異(P<0.01)。兔膝關節(jié)不穩(wěn)造模12W時各組都有MMP-13, MMP-9和CK陽性表達細胞。對照組和二磷酸鹽組陽性細胞較少，模型組陽性細胞較多。對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽性表達率分別為8.0%,12.5%和77.5%，對照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽性表達率分別為8.33%，15%和77.5%；CK陽性表達率分別為8.33%,12.5%和75%。與對照組比較，模型組有顯著性差異(P<0

24、.01)，而二磷酸鹽組無顯著性差異(P>0.05 )。二磷酸鹽能明顯減少MMP-13, MMP-9和CK陽性表達細胞;與模型組比較有顯著性差異((P<0.01)。模型組MMP-9和CK陽性數(shù)目和陽性表達率在12W較4W時顯著降低(P<0.05 )。
　　結論：膝關節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨骨吸收明顯，MMP-9和CK明顯增高是其原因之一。隨著OA的進展，骨吸收作用逐漸減弱。二磷酸鹽的抗骨吸收作用與其抑制破骨細胞產生的MMP-9和CK有關。