百草枯對人胚胎神經干細胞氧化損傷機制的研究.pdf

1、百草枯(Paraquat，PQ)是全球使用廣泛的除草劑。流行病學研究發(fā)現PQ暴露可導致多種神經系統疾病，是公認的神經毒物。發(fā)育中的腦對外源性有毒物質特別敏感，極易受到損傷。而PQ可穿透血腦屏障，影響腦組織的正常代謝及功能。多項研究也證明PQ可對多種神經細胞產生毒性作用，于是PQ所致神經發(fā)育毒性越來越得到關注。盡管PQ致神經毒性的具體機制尚不完全清楚，但大量研究表明PQ導致的氧化損傷在其中起到了重要的作用。
　　神經干細胞具有自我更

2、新和多向分化潛能，離體培養(yǎng)技術的成熟也使其逐漸成為研究神經發(fā)育毒性機制的理想模型。很多外源性化學物可通過干擾神經干細胞的正常增殖過程影響神經系統的正常發(fā)育。細胞周期及細胞凋亡都對神經干細胞的增殖狀態(tài)起到了重要作用。本研究利用人胚胎神經干細胞系，觀察百草枯引起的氧化應激對其增殖活力的影響，并探討其對細胞凋亡、細胞周期及抗氧化通路的分子機制。
　　一百草枯致ReNcell CX細胞的氧化損傷及Nrf2-Keap1/ARE通路在其中的作

3、用
　　利用MTT法檢測PQ染毒24h對ReNcell CX細胞活力的影響。采用檢測試劑盒檢測染毒后細胞內活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)的含量以及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活力。利用western blot法測定染毒后Nrf2信號通路中關鍵分子Nrf2、Keap1以及蛋白激酶PKC和CKⅡ蛋白表達情況。利用RT-PCR測定下游基因HO-1

4、、NQO1mRNA的表達情況。
　　結果顯示，PQ可使細胞活力下降，到100μM時可顯著抑制細胞活力。PQ可在無明顯細胞毒性劑量下已顯著提高細胞內ROS水平（PQ≥10μM）。細胞內SOD、CAT、GPx的活力逐漸下降，到100μM時差異具有統計學意義。培養(yǎng)液中LDH活力隨PQ濃度升高而上升，到10μM時差異具有統計學意義。細胞內丙二醛含量逐漸升高，到10μM時差異具有統計學意義。PQ可顯著上調細胞內Nrf2、Keap1蛋白表達以

5、及HO-1、NQO1mRNA的表達。隨PQ濃度上升，細胞中CKⅡ和PKC蛋白水平顯著增加。
　　這些結果提示，PQ可介導ROS的產生，導致細胞內氧化還原系統失衡，誘導脂質過氧化反應。PQ引起的氧化應激能激活Nrf2-Keap1/ARE信號通路，影響下游抗氧化酶基因的表達。CKⅡ和PKC蛋白參與了Nrf2磷酸化修飾的激活過程。二百草枯對ReNcell CX細胞增殖及凋亡的影響
　　利用EdU法測定染毒母代及子代兩代細胞的增殖情

6、況，利用PCR測定染毒母代及子代兩代細胞p53、p16、p21mRNA的表達情況。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白細胞色素C、caspase3及caspase9的表達。
　　結果顯示，在1μM時，染毒母代及子代兩代中處于S期的細胞占活細胞的比例已出現顯著下降。PQ在1μM時已顯著上調p53、p16、p21mRNA的表達，并且這一上調作用可在子代細胞中持續(xù)表達。在1μM時PQ可誘導細胞出現

7、早期及晚期凋亡。1μM時caspase3蛋白表達水平顯著上升，在10μM細胞色素C及caspase9蛋白水平顯著上升。
　　這些結果提示，PQ可抑制ReNcell CX細胞的增殖活力，在未引起細胞活力下降時已顯著抑制其增殖，并且這種抑制可持續(xù)到后代細胞。PQ可誘導p53介導的細胞周期阻滯，抑制細胞G1/S期轉換，從而抑制細胞增殖。此外PQ可激活線粒體通路，誘導早期及晚期凋亡。p53同時參與了細胞周期及細胞凋亡的調控。
　　結