MYBL2基因在結(jié)直腸癌的表達(dá)及機(jī)制的初步探討.pdf

1、結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，在西方國(guó)家，結(jié)直腸癌是導(dǎo)致癌癥死亡的第三位腫瘤。我國(guó)的飲食習(xí)慣正在不斷改變，飲食中纖維素的含量下降將可能提高結(jié)直腸癌的發(fā)病率。此外，我國(guó)的腫瘤篩查和標(biāo)準(zhǔn)化治療等程序不如西方國(guó)家規(guī)范，結(jié)直腸癌正在嚴(yán)重威脅著人們的健康。然而腫瘤是一個(gè)多因素多步驟的發(fā)病機(jī)制，迄今為止，多種癌基因及抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和提出部分闡明了腫瘤的機(jī)制。并且這些研究結(jié)果將有望成為今后治療腫瘤的新方向。MYBL2基因，又稱B-MYB，廣泛地表達(dá)于增殖

2、的細(xì)胞，MYBL2具有多種的作用，首先，它維持正常的細(xì)胞周期進(jìn)程。其次，MYBL2通過多個(gè)途徑抑制細(xì)胞的凋亡。此外，MYBL2還與細(xì)胞衰老相關(guān)。有研究表明，MYBL2還與干細(xì)胞樣表型有關(guān)。MYBL2還可以維持多能干細(xì)胞的特性，如維持自我更新性和分化等。MYBL2在多種腫瘤中呈過表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并且MYBL2的表達(dá)水平還與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。因此，MYBL2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。目前，關(guān)于MYBL2在結(jié)直腸癌中的

3、研究報(bào)道較少，主要缺乏MYBL2在結(jié)直腸癌組織中mRNA水平和蛋白水平方面的研究，也沒有建立其與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，此外，在該基因功能學(xué)的研究也只是集中在細(xì)胞周期相關(guān)方面，而MYBL2是否在結(jié)直腸癌中還具有其他的相關(guān)功能，這也將是本研究需要探討的。本研究分為三個(gè)部分：
　　目的：通過RT-PCR的方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和正常腸上皮組織的MYBL2mRNA表達(dá)情況，研究MYBL2基因在結(jié)直腸癌和正常組織的表達(dá)差異，并且探究MYBL

4、2基因與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：收集2007年至2009年在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫保存的結(jié)直腸癌RNA later標(biāo)本，其中有70對(duì)病例用于檢測(cè)癌與癌旁組織mRNA表達(dá)量，另180例腸癌組織用于研究MYBL2表達(dá)量與臨床病理特征和無病生存期(DFS)的關(guān)系。正常腸組織與結(jié)直腸癌組織mRNA表達(dá)差異用配對(duì)T檢驗(yàn)，腸癌組織中mRNA表達(dá)量與臨床病例特征之間的關(guān)系用T檢驗(yàn)和方差分析，用Kaplan-Mei

5、er法計(jì)算兩組的預(yù)后和繪制生存曲線，并用Log rank法進(jìn)行單因素分析，計(jì)算生存曲線之間的差異，通過COX回歸模型進(jìn)行多因素分析。
　　結(jié)論：在癌組織中，MYBL2的mRNA表達(dá)量明顯高于正常組織(P=0.016)，這提示了MYBL2基因可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。MYBL2基因表達(dá)量與結(jié)直腸癌的腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面相關(guān)。腫瘤最大徑＞5cm組的MYBL2mRNA表達(dá)量高于＜5cm組的患者(P=0.048)。Ⅲ期患者

6、的表達(dá)量高于Ⅱ期患者(P=0.014)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.014)，并且，MYBL2基因的表達(dá)量與N的分期呈正相關(guān)，N分期越高，表達(dá)量越高(P=0.049)。MYBL2和患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的MYBL2基因表達(dá)量顯著高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(P=0.037)。MYBL2基因表達(dá)量還與結(jié)直腸癌患者的無病生存呈負(fù)相關(guān)(P=0.017)，即MYBL2的mRNA水平越高，患者的無病生存越差。MYBL2的mRNA

7、表達(dá)量是影響結(jié)直腸癌DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　第二部分：MYBL2蛋白在結(jié)直腸癌和癌旁組織的表達(dá)差異以及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　目的：目前為止MYBL2的蛋白水平在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況未有報(bào)道，在組織中，一個(gè)基因的mRNA水平和蛋白的表達(dá)水平不一定完全一致，因此，在檢測(cè)MYBL2的mRNA水平時(shí)，檢測(cè)其在結(jié)直腸癌中的蛋白表達(dá)水平也尤為重要。此外，免疫組化的檢測(cè)方便可行，更廣泛適用于臨床診斷。在本部分中，我們將用免疫

8、組化的方法進(jìn)一步研究MYBL2的蛋白在結(jié)直腸中的表達(dá)情況，探討其蛋白水平在結(jié)直腸癌預(yù)后是否仍具有顯著意義。
　　方法：收集2005年至2007年在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行結(jié)直腸癌手術(shù)患者石蠟標(biāo)本，制成組織芯片待檢，其中癌組織標(biāo)本共97例，為結(jié)直腸癌原發(fā)灶，正常腸組織標(biāo)本104例。蛋白表達(dá)量與臨床病理特征之間的關(guān)系用卡方檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier法計(jì)算和繪制生存曲線，并用Log rank法進(jìn)行單因素分析，計(jì)算生存曲線之間的差異，

9、通過COX回歸模型進(jìn)行多因素分析。
　　結(jié)論：MYBL2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。結(jié)直腸癌組織中的MYBL2蛋白的高表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常腸上皮的高表達(dá)率。MYBL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系的分析顯示，MYBL2蛋白表達(dá)量與患者的性別、年齡、分化程度、大體類型、腫瘤大小、部位和TNM分期無明顯關(guān)系。但是，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的高表達(dá)率(93.75％)高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組(70.77％)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)。MYBL2蛋白表達(dá)

10、與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)MYBL2蛋白比低表達(dá)者具有更差的DFS(P＜0.05)。通過對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的COX多因素回歸分析，MYBL2蛋白和腫瘤分期是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　第三部分：MYBL2基因在結(jié)腸癌中機(jī)制的初步探討。
　　目的：MYBL2基因可能參與了結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展，它可能影響腫瘤的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，MYBL2基因在細(xì)胞增殖中起著重要的作用，并且還參與細(xì)胞周期的調(diào)控。因此，本部分將進(jìn)

11、一步研究MYBL2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力的影響，探討其可能的機(jī)制。
　　方法：運(yùn)用RT-PCR法及western blot法檢測(cè)各腸癌細(xì)胞株中的MYBL2基因和蛋白表達(dá)量。選擇高表達(dá)的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株，用siRNA干擾MYBL2的表達(dá)。用CCK8法檢測(cè)干擾組和對(duì)照組間的增殖差異，用流式法檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，用劃痕實(shí)驗(yàn)以及transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MYBL2對(duì)細(xì)胞遷移的影響，最后，用western blot法

12、檢測(cè)干擾組和對(duì)照組與侵襲、周期、凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。
　　結(jié)論：當(dāng)MYBL2的siRNA成功干擾結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480后，通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MYBL2可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。通過對(duì)細(xì)胞周期的研究發(fā)現(xiàn)，干擾MYBL2基因?qū)⑹辜?xì)胞停滯在G2期，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。此外，干擾MYBL2基因的表達(dá)將促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這提示了MYBL2可能通過調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等機(jī)制促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖。細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)