基因芯片技術(shù)篩選深圳市5歲以下患兒哮喘基因的研究.pdf

1、[目的]
　　1.比較深圳市5歲以下哮喘患兒與對照組的外周血基因表達譜差異。
　　2.對差異基因進行生物信息學(xué)分類，尋找小兒哮喘易感基因。
　　[方法]
　　于早上同一時間抽取3ml血液，在2小時內(nèi)分離淋巴細胞，并保存于Trizol中，將7例哮喘患兒RNA合并為實驗組，將8例呼吸系統(tǒng)炎癥非哮喘患兒RNA合并為對照組，冰凍運輸至深圳市欣海凌生物科技有限公司，進行樣品總RNA提取和純化及RNA、基因芯片的質(zhì)量控制，R

2、NA行逆轉(zhuǎn)錄，標記及純化cDNA探針，本研究用cy3標記的探針標記實驗組cDNA。
　　NanoDrop ND-1000定量每個樣本的RNA總量，樣本瓊脂糖凝膠電泳掃描評估RNA完整性。每個樣本中有5μ RNA用于標記并通過以下步驟進行數(shù)據(jù)雜交:1)反轉(zhuǎn)錄（ds-cDNA合成工具箱）;2）ds-cDNA標記（單色DNA標記工具箱）;3)數(shù)據(jù)雜交（雜交系統(tǒng)）、洗滌（洗滌緩沖劑工具箱）;4）數(shù)據(jù)掃描（微點陣掃描儀）。掃描后的圖像（TI

3、FF格式）輸入到軟件（版本2.5）中進行制表及表達數(shù)據(jù)的分析。表達的數(shù)據(jù)經(jīng)RMA(Robust Multichip Average)公式(NimbleScan軟件)標準化，之后產(chǎn)生探針水平和基因水平的文件。所有的基因水平文件均輸入到Agilent GeneSpring GX軟件（版本11.5.1）中行進一步的分析。選取信號值≥50.0的基因作為差異基因進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，通過聚類分析來揭示標本之間可辨識的基因表達譜，最后運用GO分析和P

4、athway分析用于測定這些差異表達基因的作用。
　　[結(jié)果]
　　1.RNA質(zhì)控合格，基因芯片雜交結(jié)果清晰可靠，差異表達基因的評估（盒圖、散點圖、聚類分析）表明兩組有明顯不同的表達譜，能很好的區(qū)分。
　　2.本實驗在29890個基因中，發(fā)現(xiàn)4725個基因存在差異表達，其中1660個表達上調(diào)，3065個表達下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過程中上調(diào)的基因主要涉及生物細胞過程、信號肽及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，下調(diào)的基因則主要涉及各種代

5、謝過程的調(diào)節(jié);細胞組分中，上調(diào)的基因偏重于胞外調(diào)節(jié)，而下調(diào)的基因則偏重于胞內(nèi)調(diào)節(jié);分子功能中沒有明顯的偏重。而Pathway通路分析共發(fā)現(xiàn)有88條通路，其中基因表達上調(diào)通路有22條，主要包括受體相互作用、腫瘤及黏附等方面，基因表達下調(diào)通路有66條，主要包括細胞毒性、細胞因子通路及一些免疫系統(tǒng)疾病方面。進一步對這些通路的差異表達基因進行分析發(fā)現(xiàn)有不少在3條以上的通路富集。
　　[結(jié)論]
　　1.實驗組基因表達與對照組相比存在很