β-防御素及Toll樣受體參與分泌性中耳炎發(fā)病的體內(nèi)研究.pdf

1、第一部分
　　β-防御素在分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室的表達(dá)
　　目的
　　檢測(cè)rBD-1、rBD-2mRNA在分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室粘膜中的表達(dá),初步探討β-防御素在分泌性中耳炎發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法
　　排除中耳感染的清潔級(jí)SD大鼠48只,隨機(jī)分為4組,每組12只。前3組36只行頸部切口經(jīng)右側(cè)聽(tīng)泡注入脂多糖溶液(1mg/ml)30μL,造模后分別于1、3、7天斷頭取咽鼓管鼓室粘膜;對(duì)照組12只大

2、鼠右側(cè)聽(tīng)泡注入生理鹽水30μL,左側(cè)聽(tīng)泡作為空白對(duì)照組,與造模3天組同時(shí)取咽鼓管鼓室粘膜。
　　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)咽鼓管鼓室粘膜rBD-1、rBD-2在mRNA水平的表達(dá),ImageJ軟件分析電泳圖并進(jìn)行半定量。
　　結(jié)果
　　正常SD大鼠咽鼓管鼓室粘膜存在rBD-1、rBD-2mRNA的表達(dá),rBD-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量較rBD-2mRNA強(qiáng)(P＜0.01)。造模后1、3、7天,rBD-1mR

3、NA表達(dá)變化不明顯,rBD-2mRNA表達(dá)在造模后1、3天增加明顯(P＜0.01),第7天漸回復(fù)到正常水平。
　　結(jié)論
　　在sD大鼠,rBD-1可能參與正常咽鼓管鼓室的防御功能,造模后rBD-2的表達(dá)增加可能與病原體入侵后的清除相關(guān)。
　　第二部分
　　TLR-2、TLR-4在分泌性中耳炎小鼠咽鼓管鼓室的表達(dá)
　　目的
　　用PAF誘導(dǎo)BALB/c小鼠分泌性中耳炎模型,檢測(cè)造模前后TLR-2、TLR

4、-4在咽鼓管鼓室粘膜的表達(dá),探討PAF、TLR與分泌性中耳炎發(fā)病之間的關(guān)系。
　　方法
　　SPF級(jí)BALB/c小鼠50只,排除中耳感染,隨機(jī)分為5組,每組10只。前4組經(jīng)雙側(cè)鼓膜注入PAF5μL(1μg)制作分泌性中耳炎小鼠模型,造模組8只小鼠分別于1、3、7、10天斷頭取咽鼓管鼓室粘膜;對(duì)照組8只小鼠右側(cè)聽(tīng)泡注入生理鹽水5μL,左側(cè)聽(tīng)泡作為正常對(duì)照組,與造模7天組同時(shí)取咽鼓管鼓室粘膜。每組另2只小鼠取聽(tīng)泡固定并脫鈣后制作

5、冰凍切片,行HE染色觀察造模后組織學(xué)變化。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),蛋白質(zhì)印跡(western-blot)檢測(cè)小鼠咽鼓管鼓室粘膜TLR-2、TLR-4的表達(dá);免疫熒光(冰凍切片)確認(rèn)TLR-2、TLR-4表達(dá)的具體部位。
　　結(jié)果
　　PAF1μg經(jīng)鼓膜注射誘導(dǎo)的BALB/c小鼠分泌性中耳炎,炎癥可持續(xù)10天。正常BALB/c小鼠咽鼓管鼓室粘膜存在TLR-2、TLR-4mRNA的表達(dá),兩者相對(duì)表達(dá)量比較差異不顯著;

6、PAF誘導(dǎo)后兩者表達(dá)均增強(qiáng),造模前后的表達(dá)差異有顯著性(P＜0.01);western-blot證實(shí)炎癥粘膜中TLR-2,TLR-4在蛋白水平的表達(dá)高于正常粘膜(P＜0.01);免疫熒光顯示TLR-2、TLR-4廣泛表達(dá)于鼓室粘膜,在炎癥鼓室粘膜中表達(dá)有增強(qiáng)(P＜0.01),咽鼓管粘膜中主要為TLR-2綠色熒光,鼓膜及中耳腔炎癥細(xì)胞表面主要為TLR-4紅色熒光。
　　結(jié)論
　　PAF在中耳粘膜誘導(dǎo)TLR-2、TLR-4表達(dá)上