STAT3介導(dǎo)microRNAs調(diào)控的IL-9過表達在慢性淋巴細胞性白血病免疫調(diào)節(jié)機制中的研究.pdf

1、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL，簡稱慢淋)是單克隆性小淋巴細胞惡性增殖性疾病，其特點為成熟樣的B淋巴細胞在血液、骨髓、淋巴結(jié)、肝和脾大量蓄積，最后累及淋巴系統(tǒng)以外的組織。慢性淋巴細胞白血病病因尚未明了，感染、免疫與遺傳等因素備受關(guān)注。CLL細胞形態(tài)上類似成熟淋巴細胞，實質(zhì)上是一種免疫學(xué)上不成熟、功能不完善的細胞。盡管單克隆抗體應(yīng)用及免疫治療已經(jīng)得到人們的廣泛關(guān)注并取得一定療效，但是C

2、LL仍然是一種除造血干細胞移植以外不可治愈的疾病。研究證明CLL患者體內(nèi)存在T、B細胞構(gòu)成比例及功能失調(diào)，免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，因此開展對CLL中異常免疫和免疫調(diào)控的研究有望為CLL發(fā)生發(fā)展機理的深入探討、腫瘤免疫治療及新藥開發(fā)等提供理論依據(jù)。
　　近年來，白介素9(inter leukin-9，IL-9)在腫瘤免疫中的作用已經(jīng)得到了越來越多的關(guān)注。長期以來，人們認為IL-9是Th2類細胞因子，作用于多種炎癥細胞和組織細胞，

3、在對抗寄生蟲感染和誘導(dǎo)變應(yīng)性疾病，尤其是過敏性哮喘中發(fā)揮著重要的作用。最近的數(shù)據(jù)表明，T細胞分泌的IL-9介導(dǎo)了肥大細胞的募集，參與腫瘤免疫，促進細胞轉(zhuǎn)化，促進增殖和抗凋亡活性，這些都表明IL-9在腫瘤進展中可能存在潛在作用。IL-9活化后也參與了IL-2，4，7，15參與的信號通路，這些信號通路是通過細胞因子的特異性受體鏈與STAT家族的γ鏈形成異二聚體所介導(dǎo)的。
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(Signal transduce

4、r andactiva toroftranscription，STAT3)是近年來研究異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子，STAT3能夠?qū)⒓毎獾男盘杺鬟f到細胞核，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞功能，廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程，是細胞因子受體下游區(qū)重要的信號通路之一。多項研究結(jié)果顯示，STAT3是在多種腫瘤組織與細胞株中異常表達，是促進炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子，STAT3持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了舉

5、足輕重的作用，目前已被公認為癌基因。
　　microRNAs（miRNAs）的表達水平在預(yù)測慢性淋巴細胞性白血病的臨床預(yù)后方面是很有價值的。在結(jié)構(gòu)上，miRNAs為一類短小的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA片段，長度約為19-25個核苷酸。這些RNA是從初級轉(zhuǎn)錄本，也就是pri-miRNA，轉(zhuǎn)變成為稱為pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最后成為具有功能的miRNA。miRNA來自一些從DNA轉(zhuǎn)錄而來，但無法進一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)的RNA（屬于非編碼

6、RNA）。miRNA通過與靶信使核糖核酸(mRNA)特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達。近年來的研究表明在CLL中存在幾種染色體異常，如11Q-，13Q-，17β-，和12號染色體三體的分子畸變，還包括miRNA15a和16-1的喪失或下調(diào)以及抗凋亡基因的過度表達。已有研究顯示在惡性血液病腫瘤患者血液中存在miR-15a/16，miR-29及miR-155簇表達的缺失或下調(diào)，并且它們的表達缺失或下調(diào)與IgVH表達和ZAP-70狀態(tài)呈正相關(guān)

7、。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在白血病患者中的過表達與各種染色體畸變有相關(guān)性，比如17P，提示miR-21的表達可能可以預(yù)測患者的生存率。
　　IL-9，STAT3，以及microRNAs均與腫瘤的生長有關(guān)，但IL-9在CLL患者中的表達及它們之間的交互作用尚不清楚。在本研究中，我們證實了在CLL患者血清中IL-9的表達水平明顯升高，IL-9表達的不同與CLL患者的臨床特點及預(yù)后密切相關(guān)。而pSTAT3及microRNAs的表達也

8、明顯升高。對MEC-1細胞株的實驗表明，在CLL細胞中可能存在一個“胞外IL-9-STAT3-miR-155，miR-21-胞內(nèi)IL-9”的正反饋系統(tǒng)。
　　第一部分:CLL患者及正常對照組外周血中IL-9、STAT3及microRNA的檢測
　　目的:CLL是一組在組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)及臨床預(yù)后方面均存在很大的異質(zhì)性的侵襲性惡性腫瘤。CL1的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程，目前雖然做了大量研究，其病因及發(fā)

9、病機制仍不清楚。本研究檢測了IL-9、STAT3及microRNAs在CLL病人外周血中的表達，并探討了IL-9的過表達與CLL患者預(yù)后因子之間的關(guān)系，為患者預(yù)后的評價提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.標本收集
　　2.分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononu clearcells，PBMCs)及CD19+B細胞
　　3.ELISA檢測分析
　　4.提取RNA，進行實時定量RT

10、-PCR
　　5.蛋白提取及蛋白印跡分析
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1.通過47例CLL患者外周血血清樣本的檢測，發(fā)現(xiàn)CLL患者血清中IL-9的水平增高，血清IL-9的陽性檢測率為52.4％。對20例IL-9血清水平增高的患者我們分別采用逆轉(zhuǎn)錄PCR及Western-blot檢測IL-9的表達，最終確定，IL-9在患者的外周血單個核細胞的mRNA和蛋白水平均有表達。與正常人的CD19+細胞相比，CLL患

11、者的外周血單個核細胞中擁有更高的IL-9mRNA水平(P＜0.05)。此外，通過對western-blot蛋白條帶的灰度分析，表明IL-9在CLL患者蛋白水平的表達也顯著高于正常人(P＜0.0001)。IL-9表達不同的CLL患者在年齡、性別水平上沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。但是患者血清IL-9的表達水平與臨床分期（P＜0.05），ZAP-70的表達水平(P=0.0272)，B2微球蛋白的表達水平(P=0.0101)，IgVH基因突變狀態(tài)(P

12、=0.0320)具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。CLL患者血清IL-9水平與預(yù)后之間存在相關(guān)性。
　　2.通過對20例血清IL-9增高的CLL患者的外周血單個核細胞進行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)STAT3均有磷酸化表達，通過對蛋白條帶的灰度分析表明，pSTAT3蛋白水平明顯高于正常對照，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)。
　　3.我們繼續(xù)對20例患者的外周血單個核細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)microRNA155及microRNA

13、21mRNA表達水平明顯高于正常對照，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.CLL患者IL-9水平明顯增高，升高的IL-9水平與患者的臨床分期，ZAP-70的表達水平，B2微球蛋白的表達水平，IgVH基因突變狀態(tài)呈正相關(guān)。
　　2.CLL患者的pSTAT3水平明顯增高。
　　3.CLL患者的microRNA155及microRNA21mRNA表達水平明顯高于正常對照。
　　第二部分:CLL

14、中IL-9與STAT3信號通路的相關(guān)調(diào)節(jié)作用
　　目的:我們在第一部分的實驗中已經(jīng)證明，在CLL患者的血清中，IL-9的表達有上調(diào)，而在外周血單個核細胞的蛋白水平及mRNA水平上，也存在IL-9的表達，并且IL-9的表達與患者的不良預(yù)后有相關(guān)性。我們從IL-9過表達的患者中檢測到pSTAT3水平明顯增高。在接下來的實驗中，我們將在CLL細胞株中，檢測IL-9與STAT3的磷酸化是否具有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，并檢測IL-9對CLL細胞增殖

15、及凋亡是否有影響，并探索IL-9對細胞的影響是否是通過STAT3的磷酸化起作用的，而它們之間是否存在正反饋作用。從而對IL-9影響CLL細胞生物學(xué)行為的機制進行初步的探索，達到更深入了解IL-9介導(dǎo)的信號通路的目的。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　2.MEC-1細胞的預(yù)處理
　　3.蛋白提取及蛋白印跡分析
　　4.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　5.CCK8法檢測細胞增殖
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析

16、r>　　結(jié)果:
　　1.我們檢測的CLL細胞株是MEC-1細胞株，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細胞株中，我們進行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，STAT3的磷酸化水平逐漸增高，并有時間依賴性，在加入IL-9培養(yǎng)2h的時候，STAT3的磷酸化水平達峰值。加入抑制劑（STAT3抑制劑:Wp1066）處理后，兩者的磷酸化水平明顯減低。
　　2.我們繼續(xù)用Western-blot法檢測預(yù)處理后的細胞株IL

17、-9的表達水平，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細胞株中，IL-9的表達也有時間依賴性，在加入IL-9培養(yǎng)2h的時候，IL-9表達水平達峰值。加入Wp1066(10nM)處理后，IL-9的表達明顯減低。
　　3.我們檢測預(yù)處理后細胞的增殖及凋亡情況。在加入或不加入抑制劑培養(yǎng)48h后，用IL-9終濃度為20ng/ml的IMDM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MEC-1細胞不同的時間點后，利用CCK8法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示，隨著IL-9的培養(yǎng)

18、時間增加，細胞增殖作用逐漸增加，在培養(yǎng)2h后，細胞增殖增加約20％，而這種作用能被抑制劑消除，同樣，在細胞加入IL-9培養(yǎng)2h后，流式細胞術(shù)檢測細胞株的凋亡水平發(fā)現(xiàn)，能夠減低細胞凋亡至基礎(chǔ)水平的40％左右，而抑制劑也可以消除這種作用。
　　結(jié)論:
　　1.MEC-1細胞株經(jīng)過IL-9預(yù)處理后，STAT3的磷酸化水平逐漸增高，抑制劑可消除這種作用。
　　2.MEC-1細胞株經(jīng)過IL-9預(yù)處理后，IL-9表達水平逐漸增高，

19、抑制劑可消除這種作用。
　　3.胞外IL-9可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。
　　4.胞外IL-9的刺激可引起STAT3的磷酸化，進而正反饋調(diào)節(jié)胞內(nèi)IL-9的分泌。
　　第三部分CLL中由microRNAs調(diào)控STAT3介導(dǎo)的IL-9過表達的免疫調(diào)節(jié)機制
　　目的:最近的數(shù)據(jù)表明，IL-9參與腫瘤免疫是由T細胞和肥大細胞介導(dǎo)的。它在多個轉(zhuǎn)化的細胞的促進增殖和抗凋亡活性也表明在腫瘤進展中可能存在潛在作用。本研究應(yīng)用

20、人慢性淋巴細胞性白血病細胞株MEC-1為研究對象，應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)microRNAs高表達，進一步研究CLL中由microRNAs調(diào)控STAT3介導(dǎo)的IL-9過表達的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　材料與方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　2.質(zhì)粒載體介導(dǎo)的上調(diào)慢性淋巴細胞性白血病的microRNA基因
　　3.上調(diào)microRNA基因細胞的預(yù)處理
　　4.流式細胞術(shù)檢測細胞轉(zhuǎn)染率
　　5.蛋白提取及蛋白印跡分析<

21、br>　　6.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　7.CCK8法檢測細胞增殖
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　結(jié)果:
　　1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)microRNA155和microRNA21高表達后，在加入20ng/mlIL-9的MEC-1細胞株中，我們進行Westem-blot檢測發(fā)現(xiàn)IL-9在CLL細胞中的蛋白表達水平升高(P＜0.05)，且這種作用可以被STAT3的抑制劑所抑制(Wp1066)。
　　2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)micr

22、oRNA155和microRNA21高表達后，CLL細胞增殖增加(n=3，P＜0.0001)，細胞凋亡受抑（n=3，P＜0.0001）。
　　結(jié)論:
　　1.microRNA155和microRNA21高表達引起的胞內(nèi)IL-9的分泌可以促進CLL細胞增殖，并抑制其凋亡。
　　2.經(jīng)胞外IL-9的刺激后，上調(diào)microRNA155和microRNA21基因表達后的細胞的胞內(nèi)IL-9分泌明顯增加。
　　3.IL-9可