基于量效關(guān)系分析的復(fù)方玉屏風(fēng)抗炎免疫作用及配伍機(jī)制研究.pdf

1、中藥復(fù)方是中醫(yī)防治疾病的主要形式,其安全性及有效性均優(yōu)于單味藥。方劑用藥是中醫(yī)藥體系的精髓與特色。但中藥本身具有“多成分、多作用途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)”的特點(diǎn),組方后各藥又能發(fā)生相輔相成或相反相成的相互影響,造成中藥復(fù)方藥效機(jī)制難以闡明,臨床用藥難以把握。對(duì)中藥復(fù)方的研究,應(yīng)以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),以現(xiàn)代藥理學(xué)技術(shù)為手段,采用切合中醫(yī)藥特點(diǎn)的研究方法,對(duì)方劑的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的研究,闡明復(fù)方作用的物質(zhì)基礎(chǔ),剖析其組方規(guī)律,揭示其體內(nèi)

2、過(guò)程,才能完整地展示復(fù)方作用的全貌。
　　本課題選擇扶正固本名方玉屏風(fēng)為工具藥,通過(guò)對(duì)該方藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)特征的研究,旨在探討該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ),組方規(guī)律及其體內(nèi)經(jīng)時(shí)變化過(guò)程,并為研究同類方劑提供參考。
　　玉屏風(fēng)由黃芪、白術(shù)和防風(fēng)三味藥組成,有益氣固表止汗之功效,臨床主要用于防治外感風(fēng)邪所致的反復(fù)發(fā)作性疾病。根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典,玉屏風(fēng)組方中“黃芪補(bǔ)氣固表而御外邪,扶正氣而防復(fù)發(fā),是君藥;白術(shù)健脾胃而益氣統(tǒng)血,助黃芪固里為臣藥;兼伍防

3、風(fēng)走表而祛風(fēng)邪,使外邪去營(yíng)氣和”。全方于固表之中寓有疏散,相畏相使,相反相成,安內(nèi)實(shí)外,從而達(dá)到固表御邪的目的。
　　在臨床實(shí)踐中,玉屏風(fēng)的組方及配伍并非一成不變,常以黃芪+白術(shù)這一“藥對(duì)”為基礎(chǔ),根據(jù)患者的臨床表現(xiàn),對(duì)組方加以調(diào)整,適當(dāng)?shù)卦觥p輔助藥味,或改變各藥味的劑量配比,以達(dá)到最佳治療效果,充分顯示了中醫(yī)治療“辯證施治、隨癥加減”的優(yōu)越性。
　　為探討玉屏風(fēng)抗炎免疫藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及配伍規(guī)律,本課題以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為指導(dǎo)

4、,綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、血清藥理學(xué)等現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法及靈敏度高、專屬性強(qiáng)的生物樣品檢測(cè)方法,一方面從整體、細(xì)胞、分子水平考察玉屏風(fēng)抗炎免疫效應(yīng),研究藥效的體內(nèi)經(jīng)時(shí)過(guò)程;另一方面檢測(cè)復(fù)方效應(yīng)主成分群的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)以給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的含藥血清為方劑作用物質(zhì)基礎(chǔ)的載體,綜合分析復(fù)方藥效經(jīng)時(shí)變化與體內(nèi)藥量變化的關(guān)系,以獲得復(fù)方體內(nèi)藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)信息。同時(shí)通過(guò)拆方實(shí)驗(yàn),考察不同配伍情況下,全方、單味藥及藥對(duì)的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)特征,以獲得組方配

5、伍規(guī)律的信息。通過(guò)整體研究,系統(tǒng)分析,定性與定量相結(jié)合,離體與在體相結(jié)合,宏觀與微觀相結(jié)合,試圖建立一種探討中藥復(fù)方配伍機(jī)制及量效關(guān)系的研究思路和方法,同時(shí)為玉屏風(fēng)的臨床合理用藥,制劑質(zhì)量控制及工藝改進(jìn)提供參考。
　　第一部分玉屏風(fēng)效應(yīng)主成分群的確定與定量
　　中藥復(fù)方成分復(fù)雜,單一有效成分難以涵蓋全方的作用,更不能反映各成分之間的相互作用。但與化學(xué)藥物相似,中藥方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)也是由一種或數(shù)種主要活性成分組成,它們相輔相成或

6、相反相成,共同發(fā)揮藥理作用。本研究在檢索玉屏風(fēng)及各單味藥的藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)相關(guān)信息基礎(chǔ)上,結(jié)合前期進(jìn)行的玉屏風(fēng)、單味藥、藥對(duì)煎劑的指紋圖譜和給藥后含藥血清指紋圖譜的研究結(jié)果,確定了黃芪甲苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ及升麻苷三種成分為玉屏風(fēng)的“效應(yīng)主成分群”。建立了 HPLC-ESI-MS同步檢測(cè)玉屏風(fēng)煎劑中三種成分的分析方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,該方靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,可用于玉屏風(fēng)煎劑中“效應(yīng)主成分群”的濃度測(cè)定,也可用于含黃芪、白術(shù)、防風(fēng)的中藥復(fù)

7、方制劑及中成藥主成分的質(zhì)量控制。應(yīng)用此法,檢測(cè)了玉屏風(fēng)、黃芪+白術(shù)、黃芪煎劑等樣本含量,為后續(xù)研究的用藥劑量提供了依據(jù)。
　　第二部分玉屏風(fēng)對(duì)大鼠慢性支氣管炎模型的治療作用
　　玉屏風(fēng)臨床對(duì)上呼吸道感染、哮喘及多種過(guò)敏性疾病有良好療效,其作用可能與調(diào)節(jié)免疫功能,增強(qiáng)機(jī)體抵抗力有關(guān)。本研究通過(guò)考察該方及其“君藥”黃芪、“藥對(duì)”黃芪+白術(shù)對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠的治療作用,從整體層面驗(yàn)證其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用,并通過(guò)拆方比較,分析方

8、劑作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和配伍原理。
　　用脂多糖(LPS)聯(lián)合卡介苗(BCG)制備大鼠慢性支氣管炎模型。對(duì)模型大鼠分別給予玉屏風(fēng)、黃芪、黃芪+白術(shù)煎劑,每日一次,連用21d。以地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照藥,觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、行為;光鏡觀察肺組織病理學(xué)改變;透射電鏡觀察肺組織Ⅱ型肺泡細(xì)胞、纖毛等超微結(jié)構(gòu)改變。比較各治療組與模型組、正常對(duì)照組之間的差異。
　　實(shí)驗(yàn)表明,各用藥組動(dòng)物一般狀況較模型組均有不同程度改善,其中黃芪組及玉屏風(fēng)組對(duì)體重

9、的改善更為顯著,優(yōu)于地塞米松(p<0.05及p<0.01)。組織形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明,各用藥組均使模型大鼠氣道分泌物減少,氣管上皮層修復(fù),支氣管壁炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。透射電鏡下可見(jiàn)治療組大鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞板層小體增多,纖毛密度增加。各治療組動(dòng)物超微結(jié)構(gòu)病理改變較模型組均有顯著改善。其中玉屏風(fēng)及黃芪+白術(shù)組作用更為明顯。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),玉屏風(fēng)及黃芪、黃芪+白術(shù)均對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠肺組織病理?yè)p傷有明顯的治療作用,且該作用與方劑的“君藥”黃芪密切相

10、關(guān)。
　　第三部分玉屏風(fēng)的血清藥理學(xué)
　　在確證整體藥效的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了血清藥理學(xué)研究,從離體細(xì)胞水平考察玉屏風(fēng)的抗炎免疫作用,分析藥效的經(jīng)時(shí)過(guò)程,建立其藥效-時(shí)間關(guān)系。通過(guò)拆方比較,分析全方、單藥和藥對(duì)的藥效動(dòng)力學(xué)差異,進(jìn)一步闡明方劑藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及其配伍機(jī)制。
　　用正常大鼠脾細(xì)胞和LPS+BCG誘發(fā)慢性支氣管炎大鼠肺泡巨噬細(xì)胞二種模型,分別考察玉屏風(fēng)、黃芪、黃芪+白術(shù)煎劑給藥后,不同時(shí)間點(diǎn)大鼠含藥血清對(duì)脾細(xì)胞增殖

11、率及肺泡巨噬細(xì)胞釋放IL-8能力的影響,建立藥效-時(shí)間關(guān)系。
　　含藥血清對(duì)脾細(xì)胞增殖率影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單劑量給藥后,各用藥組動(dòng)物含藥血清均對(duì)正常脾細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,而玉屏風(fēng)的作用優(yōu)于其他兩組,表現(xiàn)為Emax增高,作用時(shí)間維持24h以上,AUE顯著增大(p<0.01);多劑量給藥后,各組作用均明顯增強(qiáng),三組作用依次為全方優(yōu)于藥對(duì),藥對(duì)優(yōu)于單味黃芪。
　　含藥血清對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠肺泡巨噬細(xì)胞IL-8釋放影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

12、示,連續(xù)給藥21d后,三個(gè)給藥組含藥血清均顯示出不同程度地抑制IL-8釋放作用,其中以全方的Emax最強(qiáng)(p<0.01),AUE最大(p<0.01)。
　　結(jié)果提示,黃芪單味用藥即存在抗炎和調(diào)節(jié)免疫的藥理效應(yīng),其與白術(shù)組成藥對(duì)作用增強(qiáng),而全方藥效最強(qiáng),證實(shí)了組方的合理性。
　　第四部分玉屏風(fēng)效應(yīng)主成分群的藥動(dòng)學(xué)及其相互作用
　　本研究建立了效應(yīng)主成分群血清濃度檢測(cè)方法。以LC-MS結(jié)合乙腈沉淀蛋白法,同步檢測(cè)血清黃芪甲

13、苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ濃度。方法學(xué)驗(yàn)證表明,該法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好,符合生物樣品檢測(cè)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠灌胃給予黃芪甲苷(20mg·Kg-1)后,吸收緩慢,tmax2.10±0.55h。與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(2.165mg·Kg-1)及升麻苷(116.9mg·Kg-1)聯(lián)用后,黃芪甲苷Cmax顯著升高(P<0.05),AUC顯著增大(P<0.01),Vd變小(P<0.05),Cl減慢(P<0.01)。結(jié)果提示,與后兩者聯(lián)用,可能至少部分地

14、改善了黃芪甲苷的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn),使其能維持較高、較久的有效血藥濃度,作用增強(qiáng)。進(jìn)一步從藥動(dòng)學(xué)層面證實(shí)了玉屏風(fēng)配伍的合理性。
　　第五部分黃芪甲苷在大鼠體內(nèi)PK-PD模型
　　以玉屏風(fēng)單劑量時(shí)脾淋巴細(xì)胞增殖率作用與黃芪甲苷+白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ+升麻苷用藥后血清黃芪甲苷濃度繪制血清藥濃-時(shí)間-效應(yīng)曲線,可見(jiàn)血清藥濃與效應(yīng)基本對(duì)應(yīng),可用Emax模型描述。曲線回歸方程為:
　　E=2.3137+0.9491C-0.008121C2