環(huán)氧化酶-2-前列腺素E-,2-在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用.pdf

1、研究背景及目的
　　 AngⅡ是腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中重要的活性肽,其在體內(nèi)的作用相當(dāng)廣泛,不論是在循環(huán)中的單核細(xì)胞中,還是在動(dòng)脈粥樣斑塊的巨噬細(xì)胞中都有AnglI表達(dá),免疫組化顯示血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACEI)與AngⅡ、血管緊張素I受體(AT1R)在人的冠狀動(dòng)脈粥硬化斑塊中共表達(dá)。諸多實(shí)驗(yàn)證明RAS無論是在早期還是在晚期,無論是其短暫性升高還是持續(xù)性刺激都有促進(jìn)粥樣硬化的作用。AngⅡ與粥樣斑塊的發(fā)生及發(fā)展上有著密切

2、的聯(lián)系。另有研究證明AngII可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的MMPs的分泌,這表明了AngⅡ在調(diào)節(jié)斑塊穩(wěn)定中也起著重要的作用。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病,炎癥因子在粥樣斑塊形成、發(fā)展及破裂方面的詳細(xì)機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究顯示炎癥細(xì)胞及因子在斑塊的性質(zhì)及穩(wěn)定性上占有舉足輕重的地位。Cipollone及其同事的近幾年綜述闡述粥樣斑塊中的環(huán)氧化酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)在ACS的發(fā)生、發(fā)展上起著非常重要

3、的作用,作為炎癥因子之一的COX-2/PGE2及其信號(hào)途徑,不但參與了體內(nèi)廣泛的炎癥反應(yīng)過程,而且在早期的斑塊形成及晚期的斑塊破裂上也有著重要的作用,抑制COX-2及其下游的前列腺素E合成酶后可起穩(wěn)定斑塊的作用。Cipollone的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),COX-2、巨噬細(xì)胞及AngⅡ在斑塊的肩部共染且AngⅡ可通過AT1/COX-2/mPGES-1途徑促進(jìn)MMPs的表達(dá)。這些說明COX-2/PGE2的表達(dá)對(duì)斑塊穩(wěn)定方面有著重要的影響。

4、　　 細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinasesinducer,EMMPRIN)是單次跨膜、高度糖基化的免疫球蛋白家族。其高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面,可刺激人成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)而成為研究腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的熱點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn),EMMPRIN在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,尤其是在易損斑塊的巨噬細(xì)胞中有著高

5、表達(dá),且與MMPs的表達(dá)區(qū)域基本一致。另外如腫瘤壞死因子、C-反應(yīng)蛋白等炎癥因子亦可引起EMMPRIN的表達(dá)增加,這說明EMMPRIN與炎癥因子之間關(guān)系亦很密切。
　　 EMMPRIN是調(diào)節(jié)MMPs的產(chǎn)生及分泌的一個(gè)重要因子,MMPs是一類酶活性依賴鈣、鋅離子的蛋白酶超家族,其可分解纖維帽致使斑塊不穩(wěn)定而易致腦卒中急性冠脈綜合癥等后續(xù)事件的發(fā)生。而作為調(diào)節(jié)MMPs的一個(gè)重要因子EMMPRIN,其在易損斑塊的巨噬細(xì)胞富含區(qū)也有著高

6、表達(dá),且EMMPRIN、MMPs與巨噬細(xì)胞共定位于粥樣斑塊中,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn),亦證明在EMMPRIN在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)改變后,MMPs的表達(dá)亦會(huì)隨著EMMPRIN的改變而改變。在心肌梗死發(fā)生時(shí)EMMPRIN及MMP-9都可明顯增高,而當(dāng)心肌梗死被成功治療后其在血液中的表達(dá)水平又可恢復(fù)正常,從上述我們可以知道EMMPRIN在調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)上有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。此實(shí)驗(yàn)以THP-1巨噬細(xì)胞為模型,擬深入探討AngⅡ在THP-1巨噬細(xì)胞中對(duì)EMM

7、PRIN表達(dá)以及調(diào)節(jié)作用:1、AngⅡ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中COX-2、PGE2、EMMPRIN的表達(dá);2、COX-2、PGE2、EMMPRIN的表達(dá)上調(diào)作用是通過AT1受體,AT1受體拮抗劑可抑制該表達(dá),而AT2受體拮抗劑則無該作用;3、證明AngⅡ通過AT1/COX-2/PGE2促進(jìn)EMMPRIN表達(dá)的信號(hào)通路存在。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、人類單核細(xì)胞株(THP-1)細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(含10％的胎牛血清、100U/ml

8、的盤尼西林、100pg/ml的鏈霉素)、37℃下在含95％空氣、5％CO2的孵育箱中培養(yǎng).將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106 cells/ml移至六孔板中,每孔接種1ml。參照文獻(xiàn)進(jìn)行最優(yōu)化誘導(dǎo),加5ng/ml的佛波脂于六孔培養(yǎng)板中,誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)后,更換含無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 2、AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞活性影響測(cè)定:佛波醇誘導(dǎo)后的人類單核細(xì)胞株細(xì)胞以1×105的數(shù)量接種于96孔板上,每孔加100μl的RPMI-1640培

9、養(yǎng)基,接著以不同濃度(0.01μMto50μM)的AngⅡ?qū)θ祟悊魏思?xì)胞株誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞刺激24小時(shí),然后再用加入MTT溶液刺激4小時(shí),對(duì)照組則只加入0.1％二甲基亞砜,去除培養(yǎng)基溶于二甲基亞砜中,最后在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)其值。
　　 3、實(shí)時(shí)RT-PCR:在每孔細(xì)胞中加入1mL Trizol,按說明書進(jìn)行提取,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA A260/A280的比值及量。取1μg巨噬細(xì)胞的總RNA,根據(jù)RT盒的說明書操作,以O(shè)l

10、igo-dt12進(jìn)行cDNA的合成.基因COX-2、EMMPRIN、β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物序列分別是:COX-2:上游:5'-GATTGCCCGACTCCCTTGG-3',下游:5'-AAAACTGATGCGTGAAGTGCTG-3':EMMPRIN:上游:5'-GAA TGA CAA AGGCAA GAA CG-3',下游:5'-GAA GGA AGT GTA TGA TGG GAAT-3';β-actin:上游:5'-G

11、TGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3',下游:5'-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3'?；虮磉_(dá)用SYBR Green1熒光定量PCR在iQTM5(Bio-Rid,USA)上進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果用該儀器進(jìn)行分析。
　　 4、蛋白提取和Western blot:用4℃預(yù)冷的RIPA裂解液(含pH7.520 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCI,1％NP-40,0.5％deoxychola

12、te,0.1％SDS,1 mmol/L EDTA,10μg/mL,亮抑蛋白酶肽,2μg/mL胰蛋白酶抑制劑,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)裂解細(xì)胞,收集裂解的細(xì)胞在4℃下,離心半徑為7cm,12000轉(zhuǎn)高速離心10 min,蛋白濃度用Lorry法來測(cè)定。取50μg總蛋白樣品,與上樣緩沖液混勻后100℃煮5 min,在10％SDS-PAGE中行垂直電泳(100V,100min),室溫150 mA×90 min轉(zhuǎn)樣品至硝酸纖維素濾膜,5.0

13、％脫脂奶粉在4℃下溫和振蕩封閉3 h。取出膜結(jié)合相應(yīng)的一抗(鼠抗人EMMPRIN單克隆抗體濃度為1∶1000;兔抗人COX-2多克隆抗體濃度為1∶1000),振蕩過夜,TBST洗膜后,結(jié)合相應(yīng)的二抗(兔抗鼠紅色熒光二抗?jié)舛葹?∶5000;羊抗兔綠色熒光二抗為1∶5000),室溫30 min.用Odyssey2.0軟件進(jìn)行掃描及分析。
　　 5、PGE2的ELISA試劑盒購自中杉金橋生物有限公司,上清中PGE2含量按照PGE2酶聯(lián)

14、免疫測(cè)定試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的光密度值。
　　 結(jié)果
　　 1、成功建立THP-1巨噬細(xì)胞模型
　　 2、AngⅡ?qū)θ祟悊魏思?xì)胞株巨噬細(xì)胞活性的測(cè)定
　　 3、AngⅡ刺激巨噬細(xì)胞可增加COX-2和EMMPRIN基因及蛋白的表達(dá)
　　 4、AngⅡ刺激后上清中PGE2表達(dá)量的測(cè)定
　　 5、氯沙坦可阻滯AngⅡ引起的巨噬細(xì)胞中COX-2及EMMPRIN

15、的上調(diào)作用
　　 6、AngⅡ通過AT1/COX-2/PGE2途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中EMMPRIN表達(dá)上調(diào)
　　 結(jié)論
　　 1、AngⅡ可誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞中COX-2、PGE2及EMMPRIN的表達(dá);
　　 2、AngⅡ刺激的THP-1巨噬細(xì)胞中EMMPRIN表達(dá)的增加通過血管緊張素Ⅰ受體,血管緊張素Ⅰ受體拮抗劑可抑制該刺激作用,而血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑則無該作用。
　　 3、THP-1巨噬細(xì)