血管緊張素II誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊中細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子表達的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)已成為目前威脅人類健康的“頭號殺手”，其發(fā)生機制為易損斑塊的破裂。易損斑塊的結(jié)構(gòu)特點為：薄的偏心性纖維帽，富含脂質(zhì)粥樣壞死中心，斑塊周圍炎癥細胞大量浸潤。既往研究證實血管緊張素II(angiotensinII，AngII)在ACS的發(fā)生中有重要作用，隨著研究深入發(fā)現(xiàn)，AngII在動脈粥樣硬化斑塊中與基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloprot

2、einases，MMPs)共定位，并誘導(dǎo)斑塊內(nèi)巨噬細胞、泡沫細胞、平滑肌細胞表達MMPs，MMPs能降解纖維帽基質(zhì)，從而導(dǎo)致斑塊破裂，使斑塊失去穩(wěn)定性。大量實驗證實AngII在體內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過血管緊張素II1型受體(AT1R)介導(dǎo)的。多項大型臨床試驗證實應(yīng)用ACEI、ARB可明顯減少穩(wěn)定性心絞痛及ACS患者的心血管病死亡率及全因死亡率并不依賴于血壓的降低，但其中的相關(guān)機制目前尚不完全清楚。
　　 MMPs是參與降解

3、易損斑塊薄纖維帽的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的關(guān)鍵因子。由于MMPs在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細胞、平滑肌細胞內(nèi)高表達，并起到降解細胞外基質(zhì)作用，被證實與動脈粥樣硬化、ACS 發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系。隨著研究深入，作為誘導(dǎo)MMPs 產(chǎn)生及分泌的細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellularmatrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)在人動脈粥樣硬化斑塊的血

4、管內(nèi)膜、血管平滑肌細胞以及斑塊內(nèi)高表達。還有研究顯示，在急性心肌梗死患者EMMPRIN表達增強，EMMPRIN 刺激單核細胞/巨噬細胞表達MMP-9、平滑肌細胞表達MMP-2，而在穩(wěn)定型心絞痛患者則不增強。諸多研究證實MMPs及其上游因子-EMMPRIN在促進基質(zhì)的降解、導(dǎo)致ACS的發(fā)生等方面同樣起著極其重要的作用。
　　 核因子-κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，最廣泛地參與體

5、內(nèi)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞生長和凋亡，在動脈粥樣硬化斑塊形成及破裂中亦發(fā)揮重要作用。已經(jīng)有研究顯示，NF-κB在動脈粥樣硬化斑塊中高表達，并且定位于巨噬細胞及平滑肌細胞中，通過抑制NF-κB 活性，能夠下調(diào)炎癥反應(yīng)，與斑塊穩(wěn)定性相關(guān)。最新研究表明，EMMPRIN是NF-κB 又一新受體，在單核細胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、MMPs和細胞因子表達作用。且導(dǎo)師各項前期研究證實AngⅡ能通過NF-κB 調(diào)控EMMPRIN下游因子-MMPs的表達，但

6、在體研究AngⅡ與MMPs 誘導(dǎo)因子EMMPRIN是否存在聯(lián)系尚未見報道。
　　 此實驗以能夠形成與人類動脈粥樣硬化病理學(xué)形態(tài)極為相似的載脂蛋白E基因敲除小鼠高脂飲食飼養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型，在體探討AngII在動脈粥樣硬化斑塊中對EMMPRIN表達及調(diào)節(jié)作用：1、AngII是否可誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊中EMMPRIN的表達；2、AngII 誘導(dǎo)EMMPRIN的表達上調(diào)是否通過AT1受體，AT1受體拮抗劑可否抑制該表達；3、Ang

7、II 誘導(dǎo)EMMPRIN的表達是否通過NF-κB信號通路。從而為臨床防治ACS 提供新的理論依據(jù)和新的藥物靶點。
　　 實驗方法
　　 1、建立動脈粥樣硬化模型和實驗分組：28只6周齡雄性ApoE-/-小鼠按照普通小鼠飼料+21％豬油+0.15％膽固醇比例配制高脂飲食飼料，飼養(yǎng)12周建立動脈粥樣硬化模型。小鼠隨機分為4組，每組7只。藥物干預(yù)小鼠：AngII組背部埋入預(yù)裝入AngII的微量滲透泵，以750mg.kg-1.d

8、-1持續(xù)藥物干預(yù)4周。Val組給予AngII 干預(yù)法同上，同時給予纈沙坦混懸液40mg.kg-1.d-1灌胃，干預(yù)4周。對照1組、對照2組分別給予200ul 生理鹽水干預(yù)，方法同上，對照1組高脂飼養(yǎng)4周，對照2組高脂飼養(yǎng)8周。
　　 2、血脂檢測：ApoE-/-小鼠處死前取血清，Olympus Au2700全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。
　　 3、蘇木精-伊

9、紅染色：取ApoE-/-小鼠主動脈、頭臂動脈制備石蠟切片，脫蠟后用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察主動脈及頭臂動脈動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)。
　　 4、RT-PCR：取ApoE-/-小鼠主動脈，液氮中研磨后加入1mlRNA OUT，按說明書進行提取,紫外分光光度計測定RNA OD260/280的比值及量。取總RNA1μg，根據(jù)RT 盒的說明書操作,以O(shè)ligo-dT20進行cDNA的合成?；駿MMPRIN、MMP-9、β-actin

10、進行PCR 擴增的引物序列分別是:EMMPRIN：上游：5'-GGCAAGATAGTGGTGGTATCC-3’，下游：5'-AGTGAGATGGTTTCCCGAGTAG-3’；MMP-9：上游：5'-TGCCGTCCTTATCGTAGTCAG-3’,下游：5’-GTCACTTTCCCTTCA CCTTCG-3’；β-actin：上游：5'-AGATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3’,下游：5'-ACTC ATCGTACTCCT

11、GCTTGCT-3’。RT-PCR 儀擴增目的基因后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀分析。
　　 5、實時RT-PCR：總RNA 提取、cDNA 合成同前，基因表達用SYBR Green1熒光定量PCR 進行分析。
　　 6、蛋白提取和Western blot：取ApoE-/-小鼠主動脈，液氮中研磨后加入預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解組織，收集裂解的組織在4℃下，20000g 離心30min，蛋白濃度用考馬斯亮藍法來測定

12、。取87.5μg總蛋白樣品與上樣緩沖液，混勻后100℃煮5 min，在11％SDS-PAGE中行垂直電泳(40-65V,120min)，室溫50V×120min 轉(zhuǎn)樣品至PVDF 膜，6.0％脫脂奶粉在4℃下溫和振蕩封閉過夜。取出膜結(jié)合相應(yīng)的一抗羊抗鼠EMMPRIN多克隆抗體，濃度為1:200；鼠抗鼠β-actin 單克隆抗體，濃度為1:2000)，室溫振蕩1h，TBST 洗膜后,結(jié)合相應(yīng)的二抗(兔抗羊辣根酶標(biāo)二抗，濃度為1:2500；

13、羊抗鼠辣根酶標(biāo)二抗，濃度為1:2500)，室溫1h。用化學(xué)發(fā)光試劑盒與PVDF 膜共孵育1min后，將PVDF 膜與X 光片放入暗盒內(nèi)曝光3min，顯影后再定影。掃描膠片，用軟件分析條帶光密度值，以β-actin蛋白表達作對照作半定量分析。
　　 7、明膠酶譜法：取ApoE-/-小鼠主動脈，液氮中研磨后加入組織提取液，加入PMSF后，4℃，12000g 離心20min，收集裂解的組織在4℃下，20000g 離心30min，蛋白濃

14、度用考馬斯亮藍法測定。調(diào)整蛋白濃度，等量上樣行明膠電泳，凝膠依次行洗脫、染色,脫色，檢測MMP-9 位于藍色背景上的透亮帶(92 KD)。
　　 8、EMSA及Supershift：取ApoE-/-小鼠主動脈，按照試劑盒說明提取核蛋白，上清液即為核蛋白，蛋白濃度用考馬斯亮藍法來測定。加入各組反應(yīng)物，在4％非變性聚丙稀酰胺凝膠中電泳，200V×2h，干膠后放射自顯影，顯影后再定影。Bio-Rad 軟件檢測條帶密度。
　　

15、結(jié)果
　　 1、成功建立動脈粥樣硬化動物模型：ApoE-/-小鼠在高脂飲食(普通小鼠飼料+21％豬油+0.15％膽固醇)12周后，主動脈大體標(biāo)本油紅染色倒置相差纖維鏡下觀察小鼠主動脈內(nèi)大量動脈粥樣硬化斑塊形成，石蠟切片HE 染色倒置相差纖維鏡下觀察小鼠主動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊形成，斑塊內(nèi)大量泡沫細胞形成和堆積，主動脈內(nèi)膜增厚，并突向管腔。
　　 2、ApoE-/-小鼠頭臂動脈及主動脈石蠟切片HE 染色倒置相差纖維鏡下觀察結(jié)果

16、顯示，小鼠頭臂動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊形態(tài)與主動脈相比斑塊內(nèi)泡沫細胞形成和堆積明顯增多，主動脈內(nèi)膜明顯增厚，并突向管腔，斑塊穩(wěn)定性差，較易損。
　　 3、AngII 刺激ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊內(nèi)EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表達：對照1組、對照2組、AngII組ApoE-/-小鼠主動脈分別用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫組化、明膠酶譜法檢測基因及蛋白的表達。結(jié)果顯示An

17、gII組EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表達與對照1、2組相比明顯增加，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，基因及蛋白的表達都以β-actin作為內(nèi)對照)。
　　 4、纈沙坦可阻滯AngII 引起的ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN、MMP-9的上調(diào)作用：為證明AngII是通過AT1受體誘導(dǎo)EMMPRIN、MMP-9的上調(diào)作用，Val組小鼠同時給予AngII和纈沙坦干預(yù)后，分別用RT-PCR、Real-T

18、ime PCR及Western blot、明膠酶譜法、免疫組化法檢測小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊內(nèi)EMMPRIN、MMP-9基因及蛋白的表達；實驗結(jié)果顯示，Val組主動脈內(nèi)EMMPRIN、MMP-9的基因及蛋白的表達與AngII組相比顯著降低，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AngII 引起的ApoE-/-小鼠主動脈及粥樣硬化斑塊中EMMPRIN、MMP-9的上調(diào)作用是通過AT1受體誘導(dǎo)的，其作用可被纈沙坦所阻斷。
　　 5、A

19、ngII通過AT1R/NF-κB 途徑誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠主動脈中EMMPRIN表達上調(diào)：對照1組、對照2組、AngII組、Val組ApoE-/-小鼠主動脈用EMSA及Supershift 法檢測NF-κB的轉(zhuǎn)錄結(jié)合活性。加入核蛋白特異型抗體為對照。結(jié)果顯示AngII能夠誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠主動脈產(chǎn)生NF-κB 活性，這一過程可被NF-κB p65蛋白抗體所被抑制。
　　 結(jié)論
　　 1、AngII 可誘導(dǎo)ApoE-