MG-132對SY5Y細胞中細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子CD147表達的影響.pdf

1、目的:細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrixmetalloproteinase inducer, CD147)是種跨膜糖蛋白，能夠通過刺激成纖維細胞分泌基質金屬酶類(Matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，促使腫瘤細胞周圍細胞外基底膜和間質成分降解，從而有利于腫瘤的侵襲、轉移和擴散。隨著人們對CD147研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)其可在多種組織和細胞中表達，并且不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

2、密切相關，而且還可參與視黃醛功能、胚胎發(fā)育、胸腺T細胞發(fā)育以及其他正常生理過程。研究表明，MMP抑制劑對于治療腫瘤的成效不是十分理想，而以作用于MMP誘導劑的CD147為靶目標的治療方式可能是一種有效的技術方法。該方法可通過抑制CD147的表達來抑制MMP的分泌及其活性，從而為與MMP相關疾病的治療提供新的方向策略。于是，如何調控、影響CD147的表達成為了有待于解決的問題關鍵。目前，對于CD147的結構、功能、相互作用蛋白等有了較為廣

3、泛的了解，但對其表達調控、降解途徑的研究還沒有較為清晰的報道。生成與降解均可影響蛋白含量的水平。在真核細胞內，泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是一條主要的蛋白降解通路，介導的蛋白降解是機體調節(jié)細胞內蛋白水平與功能的一個重要機制，細胞內約80％以上的蛋白均經此途徑降解。在調整細胞周期、控制信號轉導和調節(jié)細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，成為治療腫瘤的靶點，如果通路出現(xiàn)異常則會導致疾病

4、的發(fā)生，但CD147是否也與此降解途徑相關目前還不十分清楚。研究CD147的作用機制以及其信號傳導過程，以求探索阻斷其傳導或有效抑制其作用的有效方法，也許將能為我們提供一條有效的遏制惡性腫瘤、神經退行性疾病的新路徑。
　　MG-132是種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，是第一類被發(fā)現(xiàn)和廣泛應用的蛋白酶體抑制劑，可以抑制20S催化顆粒中類糜蛋白酶活性，阻止蛋白酶體對泛素化蛋白的降解。
　　因此，本實驗在此基礎上，利用蛋白酶體抑制劑MG

5、-132對SY5Y細胞進行干預，利用兩種不同的實驗方法westernblot和in-cell western分別檢測，觀察蛋白酶體抑制劑MG-132對CD147表達的影響，初步探討CD147的降解途徑，為尋找與CD147相關的腫瘤性疾病治療提供理論依據(jù)和方向策略。
　　方法:
　　1、實驗材料
　　人神經母細胞瘤SH-SY5Y，90％ DMEM，10％胎牛血清，37℃，5％CO2培養(yǎng)，5-7天傳代。
　　2、We

6、sternblot
　　接種于6孔板內，不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0，1，2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后，RIPA裂解，經超聲破碎4℃低溫離心，吸取上清，蛋白變性，;加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳、轉膜、封閉;加入檢測抗體CD147/GAPDH，4℃搖動過夜;漂洗后加入熒光二抗孵育;Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描，以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進行測量。
　　3、In-cell western
　　接

7、種于96孔板內，不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0，1，2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描，以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進行測量。
　　4、免疫雙標染色觀察
　　24孔板培養(yǎng)SY5Y細胞48h，4％多聚甲醛固定0.5h。PBS充分清洗后山羊血清封閉2h。加入CD147一抗和ubiquitin一抗共孵育過夜，第二天清洗后分別加入熒光二抗Dylight488/Dylight594，利用奧

8、林巴斯全能顯微鏡觀察二者在細胞中的分布及定位情況。
　　結果:
　　1、Westernblot檢測，在一定時間內，隨著MG-132濃度的增大，CD147的含量相對增多;與0μmol/L組比較，5μmol/L組的CD147含量增加了約151.81±36.26％(P＜0.05)。
　　2、In-cell western檢測，在一定時間內，隨著MG-132濃度的增大，CD147的含量相對增多;與0μmol/L組比較，5μmo