MG-132對SY5Y細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147表達(dá)的影響.pdf

1、目的:細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrixmetalloproteinase inducer, CD147)是種跨膜糖蛋白，能夠通過刺激成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬酶類(Matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基底膜和間質(zhì)成分降解，從而有利于腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。隨著人們對CD147研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)其可在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)，并且不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

2、密切相關(guān)，而且還可參與視黃醛功能、胚胎發(fā)育、胸腺T細(xì)胞發(fā)育以及其他正常生理過程。研究表明，MMP抑制劑對于治療腫瘤的成效不是十分理想，而以作用于MMP誘導(dǎo)劑的CD147為靶目標(biāo)的治療方式可能是一種有效的技術(shù)方法。該方法可通過抑制CD147的表達(dá)來抑制MMP的分泌及其活性，從而為與MMP相關(guān)疾病的治療提供新的方向策略。于是，如何調(diào)控、影響CD147的表達(dá)成為了有待于解決的問題關(guān)鍵。目前，對于CD147的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用蛋白等有了較為廣

3、泛的了解，但對其表達(dá)調(diào)控、降解途徑的研究還沒有較為清晰的報(bào)道。生成與降解均可影響蛋白含量的水平。在真核細(xì)胞內(nèi)，泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是一條主要的蛋白降解通路，介導(dǎo)的蛋白降解是機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的一個重要機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)約80％以上的蛋白均經(jīng)此途徑降解。在調(diào)整細(xì)胞周期、控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，成為治療腫瘤的靶點(diǎn)，如果通路出現(xiàn)異常則會導(dǎo)致疾病

4、的發(fā)生，但CD147是否也與此降解途徑相關(guān)目前還不十分清楚。研究CD147的作用機(jī)制以及其信號傳導(dǎo)過程，以求探索阻斷其傳導(dǎo)或有效抑制其作用的有效方法，也許將能為我們提供一條有效的遏制惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的新路徑。
　　MG-132是種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，是第一類被發(fā)現(xiàn)和廣泛應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑，可以抑制20S催化顆粒中類糜蛋白酶活性，阻止蛋白酶體對泛素化蛋白的降解。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，利用蛋白酶體抑制劑MG

5、-132對SY5Y細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，利用兩種不同的實(shí)驗(yàn)方法westernblot和in-cell western分別檢測，觀察蛋白酶體抑制劑MG-132對CD147表達(dá)的影響，初步探討CD147的降解途徑，為尋找與CD147相關(guān)的腫瘤性疾病治療提供理論依據(jù)和方向策略。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)材料
　　人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y，90％ DMEM，10％胎牛血清，37℃，5％CO2培養(yǎng)，5-7天傳代。
　　2、We

6、sternblot
　　接種于6孔板內(nèi)，不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0，1，2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后，RIPA裂解，經(jīng)超聲破碎4℃低溫離心，吸取上清，蛋白變性，;加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉;加入檢測抗體CD147/GAPDH，4℃搖動過夜;漂洗后加入熒光二抗孵育;Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描，以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進(jìn)行測量。
　　3、In-cell western
　　接

7、種于96孔板內(nèi)，不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0，1，2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描，以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進(jìn)行測量。
　　4、免疫雙標(biāo)染色觀察
　　24孔板培養(yǎng)SY5Y細(xì)胞48h，4％多聚甲醛固定0.5h。PBS充分清洗后山羊血清封閉2h。加入CD147一抗和ubiquitin一抗共孵育過夜，第二天清洗后分別加入熒光二抗Dylight488/Dylight594，利用奧

8、林巴斯全能顯微鏡觀察二者在細(xì)胞中的分布及定位情況。
　　結(jié)果:
　　1、Westernblot檢測，在一定時間內(nèi)，隨著MG-132濃度的增大，CD147的含量相對增多;與0μmol/L組比較，5μmol/L組的CD147含量增加了約151.81±36.26％(P＜0.05)。
　　2、In-cell western檢測，在一定時間內(nèi)，隨著MG-132濃度的增大，CD147的含量相對增多;與0μmol/L組比較，5μmo