醋酸棉酚陰道給藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的實驗研究.pdf

1、背景：子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)是一種婦科常見病,在育齡婦女中發(fā)病率高達10％-20%,且呈逐年上升趨勢。病因及發(fā)病機制尚未明確。雖然是良性疾病,卻具有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等惡性行為;雖可以侵犯全身任何部位,但以卵巢和宮骶韌帶最為常見。EMs常引起盆腔疼痛、痛經(jīng)及不孕等癥狀,嚴重影響婦女生活質(zhì)量。EMs目前按其組織發(fā)生學、臨床表現(xiàn)以及處理的不同分為腹膜型、卵巢型及深部浸潤型3種類型。但無論那一種類型的盆腔EM

2、s患者常同時合并不同程度的深部浸潤型子宮內(nèi)膜異位癥(Deep Infiltrating Endometriosis,DIE)。DIE是Ebts的一種特殊類型,該型病灶主要分布于子宮直腸陷凹(Douglas窩)、子宮骶骨韌帶、直腸陰道隔等部位,是引起EMs疼痛(包括痛經(jīng)、性交痛、經(jīng)期排便疼痛和非周期性慢性盆腔疼痛)主要癥狀的基本根源。目前EMs的治療仍然是個棘手的問題。EMs現(xiàn)有的治療包括手術和/或藥物治療。手術治療雖可切除病灶并改善患者

3、的疼痛癥狀,以及提高患者術后妊娠率,但手術本身風險大又具有創(chuàng)傷性,且術后復發(fā)率高。藥物治療,包括GnRH-α、達那唑、口服避孕藥、孕酮等,雖可暫時縮小病灶,改善患者的臨床癥狀,但全身毒副反應大并且價格昂貴而又不能治愈,限制其長期應用。因此,探索開發(fā)有效的新藥物用以治療EMs是目前EMs臨床研究的熱點。近年臨床研究發(fā)現(xiàn),應用藥物釋放系統(tǒng)局部給藥,如芳香酶抑制劑陰道栓、達那唑陰道環(huán)、左炔諾孕酮官內(nèi)緩釋系統(tǒng)(曼月樂)等能穩(wěn)定獲得局部藥物有效治

4、療濃度達到臨床期望治療療效,而全身血液濃度很低以致于幾乎不引起藥物毒副反應,從而獲得臨床長期治療的目的。因此,設想應用療效肯定的藥物通過改變藥物給藥途徑,局部給藥使局部達到藥物有效治療濃度以期長期治療是臨床藥物治療EMs患者的一種新思路。棉酚是從錦葵科植物棉籽中分離得到的一種黃色多酚類化合物,以醋酸棉酚的形式被廣泛用于醫(yī)藥領域。醋酸棉酚口服多年來被成功用于男性避孕,并有抗腫瘤、抗病毒等活性。近年研究表明,醋酸棉酚口服給藥可有效用以治療E

5、Ms和子宮肌瘤等雌激素依賴性疾病,尤其對EMs治療療效幾乎可達100%。但遺憾的是該藥的嚴重低鉀血癥毒副反應長期阻礙該藥在臨床上推廣使用?；诖姿崦薹又委烢Ms的療效,以及局部應用藥物釋放系統(tǒng)的臨床報道。本研究構(gòu)建EMs大鼠動物模型,設計陰道棒攜帶醋酸棉酚給藥釋放系統(tǒng)用以治療大鼠EMs。旨在探索醋酸棉酚陰道棒的體外釋放規(guī)律、動物體內(nèi)動態(tài)釋放情況,觀察醋酸棉酚陰道棒治療EMs的療效,并探討其作用機理。
　　材料和方法：選用SD雌性未

6、孕大鼠,體重為(230±20)克,鼠齡8-12周,購自浙江中醫(yī)學院動物中心(n=56),于動情期或非動情期通過自體子宮內(nèi)膜層及肌層縫合于Douglas窩,分組建立EMs自體移植動物模型,造模2周/3周/4周后開腹觀察Douglas窩粘連情況、異位囊腫顏色、表面血管分布、囊液性狀,并測定囊腫體積V(A×B×C,A、B、C分別為囊腫的長、寬、高)。比較動情期及非動情期成模率的差異。選擇動情期,將SD大鼠自體子宮內(nèi)膜縫合于Douglas窩建立

7、EMs大鼠模型,模型復制后3周,第二次開腹,測定囊腫體積;將模型成功組(n=21)隨機分為(1)實驗組:醋酸棉酚陰道棒給藥組(n=10)及(2)對照組:單純硅膠陰道棒給藥組(n=11),按轉(zhuǎn)換因子折算,大鼠4.08mg/kg的劑量近似于臨床上50kg成人0.19mg/d的用量,每組于給藥7d后擇動情期觀測藥物療效。觀察粘連情況,測定囊腫體積,取囊腫及在位內(nèi)膜,置中性福爾馬林固定過夜,常規(guī)石蠟包埋、4um切片,HE染色鏡下觀(間質(zhì)、腺體、

8、囊腔),CK及Vim免疫組化染色分別鑒定腺上皮細胞及基質(zhì)細胞,bcl-2、bax免疫組化染色,并image-proplus6.0專業(yè)圖像分析軟件分析實驗組與對照組bcl-2、bax的表達有無差異。醋酸棉酚陰道棒以硅凝膠混合物為載體材料,其制備為:取硅凝膠(以下簡稱A)與硅凝膠硫化劑(以下簡稱B),按照0.9:1.0(w:w)混合均勻;另稱取醋酸棉酚適量,按照藥物與載體材料的質(zhì)量百分比為10%,加入混合均勻的硅凝膠乳液,攪拌、混勻得載藥的

9、硅凝膠乳液。將藥物的硅凝膠乳液注入中空聚氯乙烯塑料管中,在80℃條件下硫化2小時,剪開塑料管,得到醋酸棉酚陰道棒,按照劑量切割成適當?shù)拇笮?。為測定醋酸棉酚體外釋放狀況,取醋酸棉酚陰道給藥棒(含藥1mg),放入100ml的釋放介質(zhì)(0.5%Tween-80)中,37℃恒溫振蕩,60次/分鐘,于0、4、12、24、48、96h、6d、8、10、12、14、16、20、24、30、35、40、45、50d取出全部釋放介質(zhì),并補充等溫釋放介質(zhì)5

10、0ml。取樣1ml樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,取濾液20μL注入高效液相色譜儀,測定藥物含量,按照公式(1)計算藥物的累積釋放量。研究藥物體外釋放情況。F(t)=(A樣/A標)×C標×V/1000×100%(1)式中:A樣為樣品的峰面積;A標為對照品的峰面積;C標為對照品濃度(μg/mL);V為釋放介質(zhì)的體積。樣品的高效液相色譜條件為:流動相:甲醇:水(90:10);色譜柱:DikmaC18-ODS(250 mm×4.6 mm,5μ

11、m);流速:1 ml·min-1;檢測波長:238nm;柱溫:40℃;進樣量:20μL。為測定醋酸棉酚體內(nèi)動態(tài)釋放狀況,醋酸棉酚陰道棒按4.08mg/kg的劑量在模型動物(n=18)中給藥,分別于給藥后0,1,2,3,4,5,10,11,12d取血,每個時間點采3份血樣,肝素鈉抗凝,離心,分離血漿,置冰箱-20℃冷凍保存。次日進行高效液相色譜儀分離測定藥物血漿濃度。樣品的高效液相色譜條件為:流動相:0.2%HAC:乙腈=25:75;色譜

12、柱:Agilent Eclipse-XDB(150×4.6mm,5μm);流速:1.2 ml·min-1;檢測波長:235nm;柱溫:25℃。
　　結(jié)果:1.以SD大鼠為模型動物,采用自體子宮內(nèi)膜及肌層聯(lián)合縫合于Douglas窩進行EMs模型構(gòu)建,于建模第3周開腹觀察移植內(nèi)膜生長情況,選擇囊腫最大徑在2mm以上的囊腫為模型成功者?？偝赡Ｂ蕿?2.35%(42/51);動情期建模的成模率為82.93%(34/41);非動情期建模的成

13、模率為80.0%(8/10)。且動物模型建模3周組(0.3759cm3)與4周組異位囊腫體積(0.3843cm3)無明顯改變。2.醋酸棉酚陰道棒制備中醋酸棉酚與載體材料的比例為1:9時,體外實驗控制釋放效果較好,陰道棒中藥物的體外釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特點,在24小時內(nèi)藥物的釋放較快,釋放總藥物量的25%;隨后藥物的釋放速率減緩,15天以后藥物呈現(xiàn)恒速釋放的特征,每天釋放藥物量為0.3%,能穩(wěn)定釋放6個月以上。3.醋酸棉酚陰道棒以4.0

14、8mg/kg的劑量在模型動物中給藥,采血后予高效液相色譜儀分離測定藥物血漿濃度。體內(nèi)血藥濃度在24h達到高峰,隨后基本保持一極低的血藥濃度呈現(xiàn)恒速釋放的特征。4.實驗組醋酸棉酚陰道棒給藥7d后體積抑制率高于對照組處理后,但差異無統(tǒng)計學意義(p=0.247)。實驗組給藥7d后與對照組處理后腹腔粘連無統(tǒng)計學差異(p=0.790)。5.醋酸棉酚陰道棒給藥7 d后,相比對照組,實驗組異位囊腫及在位子宮內(nèi)膜均表現(xiàn)為凋亡增加。實驗組異位囊腫bcl-

15、2表達減少(p=0.012),bax表達增加(p=0.004),實驗組子宮內(nèi)膜亦較對照組子宮內(nèi)膜中bcl-2表達減少(p=0.015),bax表達增加(p=0.007),差異均有統(tǒng)計學意義。實驗組異位內(nèi)膜bcl-2,bax表達量與子宮內(nèi)膜無差異(p=0.227/0.873)。
　　結(jié)論:1.SD大鼠自體子宮內(nèi)膜及肌層聯(lián)合縫合建立EMs動物模型,動情期建模組與非動情期建模組成模率無明顯差異。且模型動物在建模3周后即成模。2.醋酸棉酚

16、陰道棒中藥物的體外釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特點,24h內(nèi)快速釋放部分能夠迅速在給藥局部達到足夠的藥物濃度并產(chǎn)生治療作用,后續(xù)的緩釋可維持藥物濃度產(chǎn)生長期的治療作用。3.醋酸棉酚陰道棒的體內(nèi)動態(tài)釋放中,24h內(nèi)血藥濃度上升迅速,然后長時間維持在一低濃度水平。4.實驗組給藥7d后體積抑制率高于對照組處理后,提示醋酸棉酚陰道棒給藥7d后抑制模型動物中異位囊腫的生長,抑制病灶體積,但此差異無統(tǒng)計學意義。應擴大樣本例數(shù)以進一步研究。但醋酸棉酚陰道棒