液體培養(yǎng)基中變鏈素的粗提與純化.pdf

1、目的：隨著抗生素的濫用，在臨床上有越來越多的耐藥菌株出現(xiàn)，人們迫切的需要尋找更有效的抗生素來替代現(xiàn)有有限的抗生素。變鏈素就是一種具有較廣抑菌譜和低作用濃度的抗菌物質(zhì)。近年來，人們對變鏈素的認識不斷增加，鑒于它的這些特性它很有可能成為新型抗生素的替代品，因此對變鏈素的進一步研究有很重要的意義。將變形鏈球菌臨床株置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離提取其產(chǎn)生的蛋白物質(zhì)，這種具有有抗菌作用的蛋白成分就被稱為變鏈素(mutacin)。變鏈素的分子量小，分

2、離提純的步驟較繁瑣。本課題從變形鏈球菌臨床分離株中篩選出產(chǎn)生變鏈素活性最強的臨床菌株，粗提其產(chǎn)生的變鏈素，再經(jīng)過固相萃取和反相液相色譜對變鏈素進行進一步的純化，以求得到較純的變鏈素，為研究變鏈素的特性并為發(fā)現(xiàn)新的變鏈素打下基礎(chǔ)，也可為將來進行氨基酸測序的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：采集20名3～6歲兒童口腔中的牙菌斑，20名兒童為隨機選取的10名高齲兒童他們的dmft≥8和10名低齲兒童他們的dmft≤1，將牙菌斑放于緩沖液中，

3、然后采用同樣的方法對這些菌株培養(yǎng)、分離、鑒定，每個兒童培養(yǎng)的菌落隨機采集5株，得到100株變形鏈球菌臨床分離株。將100株臨床分離株接種于打有小孔的TPY(胰蛋白胨-多價蛋白胨-酵母提取物液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上，48小時厭氧培養(yǎng)后將含有標準菌株ATCC10556的培養(yǎng)基傾倒于打有小孔的培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24小時后可見很多小孔的周圍有透明的抑菌圈，這種具有抑菌活性的物質(zhì)就是變鏈素，這種方法就被稱為平板法。變鏈素有抑制相似菌株生長的特性，測量并記

4、錄100株菌株產(chǎn)生的抑菌環(huán)。根據(jù)測量結(jié)果從中選取抑菌環(huán)最大的菌株，我們認為其產(chǎn)生的變鏈素活性最強，將產(chǎn)生變鏈素活性最強的菌株置于液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，再采用氯仿抽提法從菌株的液體培養(yǎng)基中粗提其所產(chǎn)生的變鏈素，然后再將粗提物置于固相萃取柱，用乙腈對粗提物進行洗脫，收集洗脫液冷凍干燥，再采用平板法檢測凍干后物質(zhì)的活性，將有活性的物質(zhì)收集溶于0.1％TFA(三氟乙酸)后經(jīng)RP-HPLC(反相高效液相色譜)進行進一步的分離純化。然后再采用平板法

5、檢測出有活性的物質(zhì)我們就認為是純化的變鏈素。
　　 結(jié)果：采用平板法測量50株高齲組對指示株ATCC10556產(chǎn)生抑菌環(huán)的最大抑菌直徑為20mm，最小抑菌直徑為7mm，平均抑菌直徑為11.5mm。50株低齲組對指示株ATCC10556產(chǎn)生的抑菌環(huán)最大抑菌直徑為27mm，最小抑菌直徑為0mm，平均抑菌直徑為7.0mm。統(tǒng)計學(xué)分析T檢驗顯示高齲組和低齲組差異具有顯著性(t值為3.102，P<0.05)。從試驗數(shù)據(jù)可以看出高齲組的2號

6、兒童的菌株產(chǎn)生的抑菌環(huán)平均直徑最大，產(chǎn)生的抑菌環(huán)平均直徑為11.5mm，此菌株產(chǎn)生的變鏈素的活性也可能是最強的。從該菌株的液體培養(yǎng)基中粗提出變鏈素，將粗提物經(jīng)過固相萃取柱初步分離，再將洗脫后的洗脫液冷凍干燥后經(jīng)RP-HPLC分離純化，得到較純的變鏈素。
　　 結(jié)論：本實驗中86％臨床株對指示株都產(chǎn)生抑菌環(huán)，很多學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)MS臨床分離株產(chǎn)生變鏈素的現(xiàn)象十分普遍，但是并不一定是高齲患者的菌株產(chǎn)生變鏈素的抑菌能力強，這很有可能是