直接測序方法研究浙江漢族人群MICA基因遺傳多態(tài)性.pdf

1、研究背景:MICA(主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類鏈相關(guān)基因A)屬于非經(jīng)典的HLA Ⅰ類分子，基因定位于人類第6號染色體。研究證實MICA與HLA Ⅰ類分子高度相似，但MICA和經(jīng)典HLA Ⅰ類分子存在不同。MICA既不和β 2微球蛋白結(jié)合，又不提呈抗原肽，但可與NKG2D受體結(jié)合調(diào)節(jié)NK細胞和T細胞功能。MICA和經(jīng)典的HLA Ⅰ類分子一樣，具有高度的遺傳多態(tài)性，目前已經(jīng)報道有64個等位基因。MICA的多態(tài)性主要集中在它的2、3、4、5號外

2、顯子，部分在1和6號外顯子。其中5號外顯子比較特殊，它含有不同數(shù)目的GCT三聯(lián)重復(fù)序列，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有八種不同的三聯(lián)體數(shù)目，A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10以及A5.1，A后面的數(shù)字代表GCT三聯(lián)體的重復(fù)數(shù)目，A5.1代表在A5的第二個(GCT)后面多了一個G。研究報道MICA和一些自身免疫性疾病、腫瘤疾病的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)，新近研究證明抗供體HLA和MICA抗體均為陰性的患者器官移植效果更佳，存活時間長，但是現(xiàn)在MIC

3、A的功能還有許多方面不明確。我們擬建立準確的MICA檢測方法，并檢測浙江漢族人群的遺傳多態(tài)性分布，為進一步深入研究MICA功能作用提供基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外檢測MICA主要為對2、3、4號外顯子進行直接測序并結(jié)合GeneScan技術(shù)檢測5號外顯子進行分型，或單獨采用GeneScan方法對MICA五號外顯子多態(tài)性分布進行研究，這類方法均存在不能有效區(qū)分部分MICA等位基因的問題。本研究我們設(shè)計方法對MICA 2-6號外顯子進行直接測序，并采用G

4、eneScan方法對5號外顯子進行分型，建立了一種系統(tǒng)、全面、準確的MICA基因分型方法，并首次在人群中對5、6號外顯子進行了序列分析。我們建立的MICA分型方法完善了以前的分型技術(shù)，獲得了浙江漢族人群MICA的遺傳多態(tài)性資料，為進一步研究MICA功能提供了科學(xué)基礎(chǔ)。 實驗方法: 1、標(biāo)本來源：標(biāo)本來自自愿無償獻血者，征集同意后采集血樣進行研究。標(biāo)本采集量為EDTA抗凝全血5ml，貯存在-20℃以下待實驗。標(biāo)本總數(shù)為10

5、0例。 2、標(biāo)本DNA提?。翰捎肞el-Freeze DNA商用抽提試劑盒。 3、2-6外顯子測序分析 3.1 PCR擴增：引物參照MICA基因序列，采用兩對引物分別對2-6外顯子進行擴增。其中第1對引物可擴增MICA 2-5號外顯子，另1對引物擴增第5、6號外顯子。PCR引物序列和擴增條件參照正文，擴增反應(yīng)體系總體積為25 μl。 3.2 PCR產(chǎn)物純化：每孔中加入核酸外切酶I 1 μl(5U)，蝦堿性

6、磷酸酶2μl(2U)，ABI公司的9700型PCR自動擴增儀進行酶切反應(yīng)，37℃ 30min，80℃ 15min。 3.3測序反應(yīng)：分別針對外顯子2、3、4、5、6設(shè)計測序引物，進行雙向測序。以純化PCR產(chǎn)物為模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)試劑盒操作進行測序反應(yīng)，ABI公司9700型PCR自動擴增儀擴增，擴增條件為95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，50℃ 10s，60℃ 4min，30個循環(huán)，

7、冷卻至4℃。 3.4測序反應(yīng)純化和電泳分析：采用乙醇／醋酸鈉法純化，然后在ABI 3730測序儀上進行測序電泳分析。 3.5測序結(jié)果分析和判斷：采用Assign 3.5分析軟件和MT Navigator軟件進行數(shù)據(jù)分析，由Assign 3.5軟件指定最終結(jié)果。 4、GeneScan檢測5號外顯子GCT重復(fù)數(shù)量 4.1 GeneScan擴增：引物參照有關(guān)文獻，正向引物5’端標(biāo)記有FAM熒光集團。引物序列和擴

8、增條件參照正文，擴增反應(yīng)體系為20 μl。 4.2 GeneScan上機檢測：GeneScan擴增產(chǎn)物1：10稀釋后，取5 μl PCR產(chǎn)物+4.8 μl甲酰胺+0.2 μl內(nèi)標(biāo)充分混勻，95℃ 4min變性后，在ABI 3730測序儀上進行GeneScan模式分析。 4.3 GeneScan結(jié)果分析和判斷：采用GengMapper v3.7自動判斷結(jié)果，根據(jù)片段長度大小推測GCT重復(fù)次數(shù)，并與5號外顯子測序結(jié)果進行驗證

9、。 5、MICA缺失型等位基因檢測：采用PCR-SSP的方法，引物參照有關(guān)文獻，一對引物擴增MICA*Del等位基因的保守序列，另外一對引物擴增人類生長激素的同源保守序列，引物序列和擴增條件見正文，擴增反應(yīng)體系為10 μl。 6、HLA-B位點參照本實驗以前建立的檢測方法，采用PCR-SBT方法。 7、統(tǒng)計學(xué)分析：人群基因頻率(gene frequency，GF)采用直接計數(shù)法計算，即檢測出的基因個數(shù)／2N(N=

10、標(biāo)本數(shù))。單倍型頻率(haplotype frequency，BF)和連鎖不平衡(LD)計算采用Arlequin 3.01軟件進行分析，Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗參照Guo和Thompson的文獻，p<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、測序方法情況：兩對引物分別擴增MICA 2-6外顯子，可得到很強的特異性條帶。雙向測序反應(yīng)后可得到清晰的測序序列，軟件可直接自動指定MICA等位基因，建立的測序

11、方法具有可行性。 2、標(biāo)準序列分析：驗證了MICA*019序列，序列已遞交GenBank，序列號為EU267602。糾正MICA命名數(shù)據(jù)庫中MICA*019等位基因1個堿基錯誤(1073bp T→A)，并得到WHO命名委員會的認可。 3、浙江漢族人群中MICA等位基因分布情況：檢測到MICA等位基因數(shù)目為14個，分布相對比較集中，最常見等位基因為MICA*00801/04。等位基因的頻率分別為MICA*00801/04(

12、27.0％)、MICA*010(18.5％)、MICA*00201(15.5％)、MICA*019(9.5％)、MICA*00901(8.0％)、MICA*027(7.0％)、MICA*01201(5.0％)、MICA*049(3.5％)、MICA*045(1.5％)、MICA*00802(1.5％)、MICA*00701(1.0％)、MICA*Del(1.0％)、MICA*004(0.5％)、MICA*00902(0.5％)。MICA

13、等位基因分布數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，觀察雜合度為0.83，預(yù)期雜合度為0.84，p=0.75。 4、浙江漢族人群中MICA等位基因5號外顯子STR分布情況：共發(fā)現(xiàn)五種重復(fù)數(shù)量：A4、A5、A5.1、A6、A9和缺失型。A5頻率(35％)最高，其次是A5.1(28.5％)、A9(15.5％)、A6(12.5％)、A4(7.5％)、MICA*Del(1.0％)。STR分布數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，觀察雜合度為0.74，預(yù)期雜合度為0.749，p=0.96

14、。 5、HLA-B基因分布情況：檢測到40種不同的等位基因。HLA等位基因分布數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計分析，觀察雜合度為0.97，預(yù)期雜合度為0.95，p=0.33。 6、MICA和HLA-B單倍型頻率及其連鎖情況分析：采用Arlequin軟件分析后得到58種單倍型，單倍型頻率分布比較離散,呈現(xiàn)高度連鎖。頻率小于4.0％的單倍型連鎖分析數(shù)據(jù)見正文。 7、MICA5號外顯子GCT重復(fù)數(shù)量與HLA-B基因關(guān)聯(lián)性分析：采用Arle

15、quin軟件分析后得到48種單倍型，單倍型頻率分布比較離散，呈現(xiàn)高度連鎖。頻率小于5.0％的單倍型連鎖分析數(shù)據(jù)見正文。 8、MICA缺失型等位基因檢測：在浙江漢族100例標(biāo)本中，2例攜帶HLA-B*4801的標(biāo)本MICA缺失型等位基因陽性(陽性率為1％)，其它98例標(biāo)本均未檢測出MICA*Del。在另外有選擇性的8例HLA-B*4801標(biāo)本中，有6個標(biāo)本含有MICA*Del。結(jié)果證實在浙江漢族人群中存在MICA等位基因缺失型，并

16、且缺失型與HLA-B*4801高度關(guān)聯(lián)。 結(jié)論: 1、本研究建立的MICA2-6外顯子測序方法和GeneScan技術(shù)檢測5外顯子是可行的。 2、驗證了MICA*019等位基因，得到WHO命名委員會的認可。 3、獲得了浙江漢族人群MICA基因遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)。 4、在等位基因水平獲取了MICA-HLA-B連鎖遺傳數(shù)據(jù)。 5、在等位基因水平獲取了MICA STR-HLA-B連鎖遺傳數(shù)據(jù)。