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文檔簡介
1、目前對于人類先天性脊柱側(cè)凸(CS)候選基因的研究尚處于初始的階段,在國內(nèi)尚是空白。近20年來對小鼠和雞胚胎發(fā)育的研究使我們對脊椎發(fā)育的分子胚胎學信息有了越來越多的了解。對于物種進化而言,不同物種間在核苷酸序列和氨基酸序列上有較高的保守性??梢酝ㄟ^系統(tǒng)回顧小鼠基因組數(shù)據(jù)庫就可以找到那些與脊椎畸形相關的基因,再通過基因圖的位置以同線性保守基因序列為基礎進一步確立人類CS可能的候選基因。 研究目的: 通過對10個候選基因SNP
2、s的篩查,探索候選基因與人類CS之間的關聯(lián),依據(jù)實驗結(jié)果提出可能的病因?qū)W假說; 通過對候選基因SNPs基因型與CS臨床表型的關聯(lián)分析,探索可能的致病基因,從遺傳學角度解釋CS臨床表型; 從基因水平探索候選基因與CS及CS臨床表型之間的關系。 研究方法:本研究采用病例—對照研究設計。 研究對象:根據(jù)入選和排除標準入選2005年10月~2008年5月期間在北京協(xié)和醫(yī)院脊柱中心收治且確診的154例中國漢族先天性
3、脊柱側(cè)凸(CS)患者和144例非先天性脊柱側(cè)凸的對照組。 研究方法: ·QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取全血DNA。 ·在NCBI—SNPs數(shù)據(jù)庫中查找上述10個基因中已知的SNPs。優(yōu)先選取雜合度高于10%,位于外顯子或有錯義突變的SNPs和位于3’—和5’—調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標志,共選取了75個SNPs。 ·將病例組根據(jù)脊椎畸形臨床特點、脊椎畸形部位、是否合并肋骨畸形
4、將病例組進行分層。 ·所有研究對象應用VeraCode GoldenGate Genotyping Assay對所選的SNPs進行基因型鑒定。 ·擬和優(yōu)度X2檢驗分析病例、對照組基因型頻率的分布是否符合H—W平衡。 ·對單個位點行基于基因型/等位基因頻率的關聯(lián)分析和基于基因型頻率的Logistic回歸分析,評估單個位點與CS發(fā)病風險的相關性。 ·應用Haploview和在線軟件SNPstats對單個基因內(nèi)
5、的多個位點進行連鎖不平衡分析、單倍型關聯(lián)分析以及非條件Logistic回歸分析,評估單倍型與CS發(fā)生風險的相關性。 研究結(jié)果: 共檢測了10個基因的75個位點,最終有11個位點被放棄,其中8個位點是因為檢出率較低,無法進行進一步的分析,另外3個位點是由于檢測結(jié)果顯示該位點無多態(tài)性而放棄,其余65個位點檢出率均>99.3%。 對照組中有2個基因共4個SNP位點的H—W平衡檢驗時P值<0.05,不符合H—W平衡,它們
6、是DLL3—rs2304222,MYLK—rs1254392,MYLK—rs820463,MYLK—rs9422。病例組中有3個基因共7個SNP位點的P值<0.05,不符合H—W平衡,它們是LMX1A—rs12029324,LMX1A—rs12023709,LMX1A—rs1819768,LMX1A—rs16841013,MYLK—rs9422,TBX6—rs3809624。 DLL3、DVL2、HES7、LMX1A、MYLK、
7、TBX6、WNT3A等7個基因內(nèi)的位點之間有連鎖不平衡關系。DLL3有四個位點(rs2304223、rs1110627、rs2304214和rs3212276)存在連鎖不平衡關系,組成連鎖不平衡block。 共篩選了DLL3的5個SNP位點:rs2304222,rs2304214,rs2304223,rs3212276,rs1110627。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點相關的陽
8、性結(jié)果;在對單個位點的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點;對DLL3中多個位點進行單倍型關聯(lián)分析和Logistic回歸分析,均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。這說明這5個位點的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關,對中國漢族人群來說,DLL3基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 共篩選了DVL2的5個SNP位點:rs222850,rs222837,rs222836,rs20742
9、16,rs2074222。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點相關的陽性結(jié)果;在對單個位點的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點;對DVL2中多個位點進行單倍型關聯(lián)分析和Logistic回歸分析,均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,這說明這5個位點的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關,對中國漢族人群來說,DVL2基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因
10、素。 共篩選了HES7的3個SNP位點:rs1442849,rs3027279,rs1348325。結(jié)果提示HES7基因?qū)τ谟蟹止?jié)障礙和有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病來說是易感基因。 共篩選了LMX1A的13個SNP位點:rs4657412,rs12029324,rs12023709,rs12040140,rs6667188,rs1532815,rs1819768,rs6671290,rs16841029,rs46564
11、35,rs1354510,rs16841013,rs16840972。結(jié)果說明,LMX1A可能是有形成障礙的先天性脊柱側(cè)凸和有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸的易感基因。 共篩選了MYLK的8個SNP位點:rs1254392,rs3732487,rs40305,rs1350152,rs820463,rs9422,rs13080634,rs12172926。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中并沒有得到與這8個位點
12、相關的陽性結(jié)果;在對單個位點的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點;對MYLK中多個位點進行單倍型關聯(lián)分析和Logistic回歸分析,均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進一步分層分析中發(fā)現(xiàn),在對腰椎畸形的CS組和對照組進行比較時,兩個位點的基因型在兩組間存在顯著性差異;在對多位點單倍型的關聯(lián)分析和Logistic回歸分析時無陽性結(jié)果。這說明MYLK基因可能是腰椎畸形的先天性側(cè)凸發(fā)病的易感基因。 共篩選了NOTCH1的
13、5個SNP位點:rs2229971,rs10521,rs2229974,rs6563,rs4489420。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點相關的陽性結(jié)果,對單個位點Logistic回歸分析、多位點單倍型關聯(lián)分析和Logistic回歸分析時也無陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,這說明這5個位點的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關,對中國漢族人群來說,NOTCH1基
14、因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 共篩選了PAX1的3個SNP位點:rs17861031,rs6047590,rs6035934。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中我們并沒有得到與這3個位點相關的陽性結(jié)果,對單個位點Logistic回歸分析、多位點單倍型關聯(lián)分析和Logistic回歸分析時也無陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,這說明這3個位點的遺傳多態(tài)性和C
15、S易感性無關,對中國漢族人群來說,PAX1基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素 共篩選了SIM2的3個SNP位點:rs2073416,rs2051397,rs2073601。這3個位點的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關,對中國漢族人群來說,SIM2基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 篩選了TBX6基因的2個SNP位點:rs8060511和rs3809624。實驗結(jié)果提示TBX6基因是中國漢族人群先天性脊柱側(cè)
16、凸的易感基因,進一步的分析說明TBX6基因?qū)τ蟹止?jié)障礙的先天性脊柱側(cè)凸、無肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸、有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸均有關聯(lián)。 共篩選了WNT3A基因中的17個SNP位點。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點關聯(lián)分析中并沒有得到與這17個位點相關的陽性結(jié)果分析結(jié)果說明WNT3A遺傳多態(tài)性和CS易感性無關,對中國漢族人群來說,WNT3A基因的遺傳變異可能與CS發(fā)病相關聯(lián),進一步
17、的分析說明WNT3A基因?qū)o肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸、有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸均有關聯(lián)。 結(jié)論: 在中國漢族人群中HES7、LMX1A、TBX6和WNT3A基因多態(tài)性與先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病相關,有可能是決定CS個體遺傳易感性的重要因素。 HES7基因?qū)τ谟蟹止?jié)障礙和有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病來說是易感基因;LMX1A可能是有形成障礙的先天性脊柱側(cè)凸和有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸的易
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