大鼠彌漫性軸索損傷伴神經(jīng)細(xì)胞凋亡和pStat1表達.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal．injury，DAI)屬于彌漫性腦損傷 ，指頭部遭受特殊鈍性外力產(chǎn)生加速性運動時，在剪應(yīng)力的作用下，腦內(nèi)發(fā)生的廣泛分布的以神經(jīng)軸索斷裂為特征的一系列病理生理變化。這種改變既可以單獨出現(xiàn)也可以同其他的病理改變相伴隨出現(xiàn)。意識障礙是其典型的表現(xiàn)，預(yù)后多差，重型長期處于去腦強直、植物生存狀態(tài)。 以往研究從腦血流改變、缺血再灌注-氧化損傷、鈣離子超載、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子表達改

2、變等方面入手，認(rèn)識到以上病理生理機制均在DAI的發(fā)展過程中起到重要作用，相互作用影響著損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷、修復(fù)和再生。Andre Wennersen等應(yīng)用TUNEL的方法觀察到陽性細(xì)胞的總數(shù)在傷后的第一天和第二天達到最高，并觀察到腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞表達Bax、Bcl-2增高，證實了腦損傷后可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activat

3、orof transcription)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程；并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化過程，與腦腫瘤、缺血再灌注等病理生理過程密切相關(guān)。Statl是第一個發(fā)現(xiàn)的Stats成員，可被INF-a、INF-γ,、IL-6、IL-10、GM-CSF、FGF和PDGF等細(xì)胞因子激活。Stat1介導(dǎo)Fas、FasL、Bax、Caspases1等細(xì)胞凋

4、亡相關(guān)基因的表達，同時對Bcl-2和Bcl-x等抗凋亡基因的表達起到負(fù)調(diào)控作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)免疫、神經(jīng)組織的修復(fù)與再生以及神經(jīng)疾病中的病理機制等方面都起到重要的作用。已有研究發(fā)機械性腦損傷(traumic braininjury,TBl)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生，且隨時間的變化而變化。 TB1后的病理生理改變可造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，Stat1．可參與促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。DA

5、I后是否激活了JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的病理過程還不清楚。本實驗復(fù)制了Marmarou A等人于1994年首次報道的自由落體撞擊模型，以觀察DAI后是否有Stat1的激活，并初步探討了其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡間的相關(guān)關(guān)系，為進一步闡明DAI的病理生理學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。 方法：DAI模型的制備：稱重麻醉大鼠，切開皮膚，分離各層組織，暴露顱骨頂部位于冠狀縫和人字縫之間的顱骨穹隆處，將一直徑為1cm的不銹鋼墊片固定于

6、該處，縫合多余手術(shù)切口。大鼠清醒后，乙醚麻醉大鼠，將其俯臥固定于致傷裝置的海綿床上。保證大鼠頭部位置端正，顱項水平，并使墊片的中央正對致傷裝置有機玻璃管的下口。重錘(銅質(zhì)，450g)從指定的高處(1.75m)自由下落致圓盤形的墊片上，海綿床連同大鼠要在打擊后迅速撤離有機玻璃管下方以確保是單次打擊。隨后將大鼠轉(zhuǎn)移至操作臺上觀察幾分鐘。檢查顱骨頂部是否有骨折發(fā)生，縫合頭皮。 在撞擊后死亡的大鼠以及顱骨發(fā)生骨折的大鼠都排除出實驗組，選

7、取打擊后動物立即出現(xiàn)昏迷，且昏迷時間在3～5min內(nèi)，24h內(nèi)行為學(xué)評分10分以下的大鼠，作為模型列入實驗組。健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重240～280克，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組和打擊后不同時間組(6h、12h、24h、48h、72h、5d和10d)。正常對照組大鼠不作處理；假手術(shù)組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理，但不予真正的打擊；實驗組大鼠經(jīng)過手術(shù)后，按上述方法給予打擊，按打擊后按不同時間處死。觀察打擊后大鼠的行為學(xué)

8、表現(xiàn)，麻醉灌注后取全腦，制作石蠟切片，采用銀染和免疫組織化學(xué)的方法觀察大鼠腦組織的病理改變。用流式細(xì)胞檢測腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況，用RT-PCR的方法測定腦組織中bax/bcl-2mRNA的相對表達水平，用免疫組織化學(xué)的方法測定腦組織中各個腦區(qū)Phospho-Stat1(Ser727)在損傷后不同時間點的表達情況。 計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素

9、方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1、組織病理學(xué)變化：Bielschowsky’s鍍銀染色軸索的形態(tài)學(xué)變化：對照組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元軸突直且長，表面光滑。損傷組大鼠打擊后12h可見皮質(zhì)和小腦等部位的輕度水腫、瘀血，胼胝體、腦干和小腦等部位神經(jīng)軸索扭曲、腫脹，呈串珠狀、波浪狀改變，周圍間質(zhì)水腫，24h及48h上述變化更加明顯。5d上述變化明顯好轉(zhuǎn)，10d已

10、不明顯。 酯化銀染色軸索的形態(tài)學(xué)變化：對照組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，未見有黑色銀顆粒沉積的變性損傷軸索。損傷組大鼠打擊后6h可見皮質(zhì)、海馬和小腦等部位出現(xiàn)有黑色銀顆粒沉積的變性損傷軸索，走形迂曲，局部擴大如串珠。12h、24h和48h上述改變更加明顯，以24h最為顯著。5d和10d仍能觀察到異常軸索，但數(shù)量明顯減少。 B-APP的免疫組織化學(xué)染色：對照組腦組織中有B-APP的弱表達，但軸突中未見其積聚表達。實驗組打擊后6h可見有

11、B-APP表達的升高，但軸突中沒有明顯的積聚現(xiàn)象。12h其表達量繼續(xù)升高，并開始在軸突中積聚，48h軸突中的積聚最為明顯。而后表達下降，且在軸突中逐漸減少消失。 2、腦組織中腦細(xì)胞凋亡的情況：正常對照組和假手術(shù)對照組的細(xì)胞凋亡率很低，6h組和12h組凋亡率較對照組稍有增高，但沒有明顯的差別；24h組凋亡率較對照組和其他各實驗組有顯著升高(P<0.01)；48h組凋亡率較24h組有所下降，但較對照組和其他各組均有明顯的差異(P<0

12、.01)：72h和5d組凋亡率為進一步下降；10d組凋亡率明顯降低，但較對照組仍有明顯的差異(P<0.05)。 3、腦組織中bax及bcl-2 mRNA的比值變化情況：6hbax/bcl-2比值與對照組相比有所升高，但沒有明顯差異。12h bax/bcl-2比值進一步升高，與對照組相比有明顯差異(P<0.05)，24h bax/bcl-2比值達到最大值。48h baxbcl-2比值開始下降，72h和5d bax/bcl-2比值較

13、24h有明顯降低，但較對照組仍有明顯的差異(P<0.05)。10dbax/bcl-2比值較前幾組繼續(xù)下降，且較對照組已沒有明顯差異(P>0.05)。 4、大鼠腦組織Ser p-Stat1在不同時間點的表達：對照組4大鼠腦組織Ser p-Stat1在不同時間點的表達：對照組大鼠腦組織中Ser p-Stat1有弱的表達，但量很低。實驗組大鼠打擊后6h可見Ser p-Stat1表達的升高，主要分布于細(xì)胞核中，且與對照組有明顯差異(P

14、<0.01)。12h其表達量繼續(xù)升高，至24h表達量達到峰值，48h其表達開始下降。10d時表達較24h有非常明顯的降低，但較對照組仍有明顯差異(P<0.01)。其中海馬神經(jīng)細(xì)胞Ser p-Statl的表達在打擊后6h開始升高，12h表達量增高達到峰值，24h開始下降。 實驗組中陽性細(xì)胞主要是神經(jīng)元，在皮層、海馬有少量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在腦干和胼胝體有部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在小腦髓質(zhì)則主要是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 5、腦組織中Pho

15、spho-Stat1(Ser727)的表達變化與腦細(xì)胞的凋亡率的變化具有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r為0.761，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：采用MarmarouA的自由落體撞擊模型復(fù)制了大鼠彌漫性軸索損傷模型；DAI后腦組織中有腦細(xì)胞的凋亡，24h達到峰值；DAI后大鼠腦組織中Ser p-Stat1的表達升高，24h達到峰值；Stat1的激活與腦細(xì)胞的凋亡有正相關(guān)關(guān)系；DAI后大鼠腦組織中Ser p-Stat1不僅在神經(jīng)元