大鼠彌漫性軸索損傷神經(jīng)元、軸索繼發(fā)性改變的實驗觀察.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)亦稱彌漫性白質損傷，是頭部在機械性外力作用時，在剪應力的作用下引起的以白質的廣泛變性為主要特征的一種腦損傷。DAI可單獨發(fā)生，也可伴發(fā)各種顱腦損傷，是顱腦損傷中最常見的致命性損傷。DAI是顱腦損傷后出現(xiàn)無血腫性持續(xù)昏迷、嚴重神經(jīng)功能障礙和植物生存的最常見原因，致殘率和致死率高，是法醫(yī)學研究的重點和難點課題之一。 大部分DAI的肉眼改變極其微小，很難通過死后

2、尸檢的肉眼改變進行診斷，只能通過微觀的形態(tài)學驗證。彌漫性腦白質尤其是在胼胝體和腦干部位的神經(jīng)纖維的形態(tài)學改變是診斷DAI的主要病理學依據(jù)。本實驗通過參照1994年Marmarou A等的方法建立大鼠彌漫性軸索損傷模型，并觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞體和軸索發(fā)生的繼發(fā)性病理改變，進一步探討彌漫性軸索損傷的病理機制，以期為法醫(yī)病理學和法醫(yī)臨床學鑒定提供實驗依據(jù)。 方法：Sprague-Dawley大鼠(體重：383±26克)隨機分為12

3、組：正常對照組、手術對照組、損傷組；損傷組包括打擊后不同時相組：0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d。參照Marmarous A等的方法制備大鼠腦彌漫性軸索損傷模型：稱重后水合氯醛麻醉大鼠，達到一定麻醉深度后沿頂部正中線切開頭皮，分離皮下組織、骨膜，暴露冠狀縫和人字縫之間顱骨，將一直徑為10mm、厚3mm的不銹鋼墊片固定于顱骨項部冠狀縫和人字縫中間位置，縫合多余手術切口。次日，乙醚麻醉大鼠，將其俯臥固定于致

4、傷裝置的樹脂盒內的海綿床上(12×12×43cm)，保證大鼠頭部位置端正，并使墊片的中央正對致傷裝置有機玻璃管的下口。重錘(銅質，450g)從指定的高處(2m)自由下落至圓盤形的墊片上，海綿床連同大鼠要在打擊后迅速撤離有機玻璃管下方防止二次打擊。隨后將大鼠轉移至操作臺上檢查疼痛反射及有無顱骨骨折。正常對照組大鼠不作任何處理；手術對照組大鼠給予手術及打擊前處理，但不予打擊；損傷組按上述方法給予打擊，根據(jù)打擊后不同時間處死。大鼠麻醉后全身灌

5、注固定取全腦，制作石蠟切片，采甩HE染色、硫瑾染色、Gless r嗜銀染色和免疫組織化學的方法觀察損傷的神經(jīng)元胞體和軸索形態(tài)學改變，并用TUNEL法檢測神經(jīng)元的DNA損傷情況。 數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差(Mean士SD)表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，以p＜0.05為有顯著性差異。 結果： 1損傷組大鼠打擊后即刻出現(xiàn)昏迷和呼

6、吸暫停(≤20s)，平均昏迷時間為6.90±2.48min。根據(jù)大鼠行為學評分標準損傷組大鼠各項指標均伴有不同程度的下降，平均分數(shù)為6.5±2.05。 2手術對照組和正常對照組相比無明顯改變；損傷后早期海馬、皮層和腦干等部位神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜不清，核仁深染偏位或消失，并可見到深染的粉紅色固縮神經(jīng)元。24h粉紅色固縮神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，神經(jīng)細胞周圍出現(xiàn)空隙，核固縮，胞質和胞核黏附(稱為暗細胞)，7d組仍可見少量暗細胞存在。

7、 3 硫瑾染色結果：神經(jīng)元尼氏小體從核周開始崩解呈塵狀顆粒，并逐漸向外擴展，進而完全溶解消失。損傷后3h大腦皮層和海馬開始出現(xiàn)陽性細胞的增多，至傷后48h達到高峰，傷后7d陽性細胞數(shù)仍高于正常對照組和手術對照組(p＜0.05)。 4 GLESS氏嗜銀染色結果：正常對照組和手術對照組腦組織結構清晰，神經(jīng)纖維排列整齊，表面光滑。損傷組腦組織早期無明顯改變，打擊后12h胼胝體和腦干部位神經(jīng)軸索呈現(xiàn)扭曲、腫脹、波浪狀改變和軸索收縮球形成

8、，24h及48h變化更加明顯，72h以后受損軸索數(shù)目減少，呈恢復期改變。 5 β-APP的免疫組織化學染色結果：正常對照組和手術對照組軸索無陽性表達。損傷組于打擊后1h可見軸索β-APP陽性表達增高，胼胝體和腦干部位出現(xiàn)大量呈腫脹、波浪狀改變的軸索以及軸索收縮球。24h及48h的β-APP表達量達到峰值，受損軸索直徑增大，72h以后受損軸索數(shù)目減少，7d組與對照組比較無明顯差異(p＞0.05)。 6 TUNEL法檢測細胞

9、凋亡結果：正常對照組、手術對照組以及損傷后0h、1h、3h組僅發(fā)現(xiàn)個別染色陽性細胞，損傷后6h染色陽性細胞數(shù)目開始增多，海馬凋亡細胞數(shù)在損傷后24h到達高峰，大腦皮層48h凋亡達到高峰，損傷后7d大腦皮層仍有大量陽性細胞表達，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。 結論： 1本實驗成功建立了大鼠DAI模型，制作簡便，重復性好，結果可靠，可用于DAI的基礎研究。 2.DAI是一個漸進的過程，隨著時間的推移，呈現(xiàn)