乙醇胚胎毒性對大鼠聽覺系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 酒精類飲料在世界各地有很大的消耗量和消費(fèi)人群，慢性乙醇中毒和乙醇依賴已成為常見的醫(yī)學(xué)和社會問題，因此很多學(xué)者對乙醇毒性問題進(jìn)行了多方面的研究。近來研究發(fā)現(xiàn)，乙醇和與其相關(guān)的基因相互作用(包括和乙醇代謝相關(guān)的基因和受乙醇影響受體的基因)，改變了乙醇在體內(nèi)的正常代謝過程和受乙醇影響受體的正常表達(dá)，通過多種途徑和方式使飲酒者個體及和其子代產(chǎn)生多方面、多器官功能、發(fā)育等異常。妊娠期母體乙醇暴露嚴(yán)重者可導(dǎo)致其子代發(fā)生胎兒酒精綜合

2、癥(fetalalcoholsyndrome，F(xiàn)AS)，出現(xiàn)畸形、早產(chǎn)、多器官發(fā)育不良、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等，而目前尚無逆轉(zhuǎn)FAS的治療辦法。 隨著各種聽覺神經(jīng)功能的測試方法不斷進(jìn)步、完善，關(guān)于乙醇直接毒性和胚胎毒性對聽覺系統(tǒng)造成諸多影響的研究也越來越多：例如對飲酒者測試聽性腦干反應(yīng)(auditorybrainstemresponse，ABR)，發(fā)現(xiàn)ABR各波潛伏期延長，且與其累計(jì)乙醇攝入量存在對數(shù)關(guān)系，這可能是乙醇的直接毒性導(dǎo)致

3、飲酒者腦干損傷使神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度降低而引起聽功能異常。而對胚胎期乙醇暴露的幼鼠測試聽覺事件相關(guān)電位(auditoryevent-relatedpotential，AERP)，發(fā)現(xiàn)其測出率降低、潛伏期延長、幅值降低，波形不規(guī)則，這表明乙醇的胚胎毒性還可導(dǎo)致子代高級聽覺功能異常。 既往對乙醇胚胎毒性與聽覺系統(tǒng)功能的研究揭示了許多聽覺功能異常的現(xiàn)象和規(guī)律，但其具體的作用機(jī)制尚在進(jìn)一步探尋中。正是基于此研究背景，本實(shí)驗(yàn)通過建立乙醇胚胎毒

4、性大鼠動物模型，測試其ABR，并結(jié)合觀察聽覺系統(tǒng)發(fā)育、病理形態(tài)學(xué)改變和聽覺神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)免疫表達(dá)情況，探討乙醇胚胎毒性對大鼠聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的影響，探尋乙醇胚胎毒性影響聽覺系統(tǒng)的可能作用機(jī)制。 本課題為廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：032853)。 目的和意義 通過使母鼠在孕期經(jīng)灌胃注入50％分析純乙醇，建立胚胎期乙醇暴露大鼠動物模型。測試不同劑量乙醇暴露下仔鼠ABR，檢查聽覺神經(jīng)系統(tǒng)功能情況，觀察仔鼠

5、聽覺系統(tǒng)發(fā)育、病理學(xué)和聽覺神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glutamicacid，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid，GABA)免疫反應(yīng)情況，探討乙醇胚胎毒性對大鼠聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的影響及可能作用機(jī)制，為預(yù)防、治療相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)。 方法 本實(shí)驗(yàn)分三個部分。 第一部分：建立乙醇胚胎毒性大鼠動物模型。 選擇健康、耳廓反應(yīng)靈敏、性發(fā)育成熟、有孕育史的雌、雄S-D大鼠按2：1隨機(jī)

6、配對合籠，通過記錄雌鼠體重變化、有無陰道栓、陰道是否擴(kuò)大、陰道涂片判斷其是否交配、受孕成功。確定交配日期后于交配后第8天通過灌胃途徑給予受孕雌鼠50％分析純乙醇，所產(chǎn)仔鼠即為乙醇胚胎毒性大鼠。 第二部分：測試ABR。 仔鼠40天齡后選擇同天齡正常大鼠作為對照組測試ABR，以同時引出Ⅱ波和Ⅲ波作為判斷ABR反應(yīng)存在的標(biāo)準(zhǔn)，記錄Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、到Ⅴ波的潛伏期和波幅，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件將結(jié)果進(jìn)行匯總、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分

7、析結(jié)果。(第二部分已發(fā)表在《臨床耳鼻咽喉科雜志》2006年第20卷第7期第319-321頁) 第三部分：聽覺系統(tǒng)病理變化觀察。 完成ABR測試后處死各組大鼠，保留耳廓、外耳道軟骨部以便于切片定位，切下顳骨和腦部標(biāo)本，修剪后置入福爾馬林溶液中固定，加入乙烯二胺四醋酸脫鈣1個月。采用平頭顱位定位，耳間線中點(diǎn)為嘴尾側(cè)坐標(biāo)0點(diǎn)，從0點(diǎn)處冠狀位切開，分別向前、向后連續(xù)行冠狀切片，常規(guī)HE染色及常規(guī)SP法免疫組化檢測GABA、Glu

8、表達(dá)，光鏡下觀察外耳、中耳、內(nèi)耳、螺旋神經(jīng)節(jié)、耳蝸核組織結(jié)構(gòu)及聽覺神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Glu和GABA免疫組化染色情況。 結(jié)果 子代大鼠生存情況：高劑量組仔鼠共17只，40天齡前夭折6只，測試ABR中麻醉死亡4只。低劑量組仔鼠共16只，40天齡前夭折3只，測試ABR中麻醉死亡3只。對照組10只，無夭折、麻醉死亡。對最后完成ABR測試及病理學(xué)觀察的例數(shù)行R×C表資料x2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，x2=9.109，v=2，P=0.009，說

9、明各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 測試ABR：對照組Ⅰ波測出率90％，高劑量組和低劑量組Ⅰ波測出率降低(分別為14％、30％)。使用R×C表資料x2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，x2=23.100，v=2，P＜0.001，說明各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組和低劑量組的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波潛伏期均長于正常組，以高劑量組的潛伏期為最長。使用單因素方差分析(One-wayANOVA)、非平衡設(shè)計(jì)、LSD多重比較方法的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示高劑量組、低劑量組

10、和正常組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波的潛伏期之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。高劑量組和低劑量組的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ波潛伏期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.002)。高劑量組和低劑量組的各波幅值均低于正常組，而高劑量組的波幅最低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組Ⅱ波、Ⅲ波波幅方差齊性，高劑量組和對照組Ⅱ波、Ⅲ波波幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ⅱ波P=0.033，Ⅲ波P=0.004)，高劑量組和低劑量組Ⅱ波波幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。三組的Ⅳ波、Ⅴ波波幅方

11、差齊性檢驗(yàn)提示其不具有方差齊性，使用Tambane'sT2多重比較的分析方法結(jié)果顯示：高劑量組和對照組Ⅳ波、Ⅴ波波幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.001)。高劑量組和低劑量組Ⅳ波、Ⅴ波波幅差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.002，P=0.034)。從對照組、低劑量組到高劑量組ABR的Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波和Ⅴ波幅值依次降低。 聽覺系統(tǒng)病理變化觀察：胚胎期乙醇暴露影響大鼠聽覺系統(tǒng)發(fā)育，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)Glu、GABA含

12、量下降。聽覺感受器主要病理表現(xiàn)為高劑量組和低劑量組大鼠中耳腔內(nèi)滲液，炎細(xì)胞浸潤，骨螺旋板疏松，發(fā)育不成熟，膜蝸管組織水腫，螺旋器細(xì)胞發(fā)育不成熟，細(xì)胞形態(tài)較幼稚，界限不清，排列紊亂，其下間質(zhì)疏松水腫。螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)細(xì)胞發(fā)育不一致，大小不均勻，個別細(xì)胞有固縮、調(diào)亡，部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增寬，神經(jīng)纖維腫脹，排列紊亂。耳蝸核神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育欠佳，神經(jīng)元細(xì)胞突起少，體積小，部分細(xì)胞腫脹，周圍間隙增大，部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)單個細(xì)胞核固縮，變性壞死。免疫

13、組化顯示螺旋神經(jīng)節(jié)和耳蝸核神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Glu、GABA含量下降，對照組聽覺神經(jīng)元內(nèi)Glu、GABA含量高。病理變化的程度、范圍和乙醇暴露劑量相關(guān)：高劑量組病變程度嚴(yán)重、范圍廣，神經(jīng)遞質(zhì)下降幅度大，而低劑量組較輕、范圍較小，神經(jīng)遞質(zhì)下降幅度小。 結(jié)論 通過使母體在孕期第8天給予乙醇暴露可成功建立乙醇胚胎毒性大鼠動物模型。 乙醇胚胎毒性對仔鼠聽覺神經(jīng)系統(tǒng)有明顯影響。聽覺神經(jīng)功能異常，表現(xiàn)為沖動傳導(dǎo)減慢，ABR波幅值低