卵泡發(fā)育期和胚胎植入期苯與甲醛聯(lián)合暴露致小鼠胚胎毒性.pdf

1、苯和甲醛均是工業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)原料，廣泛存在于建筑材料和居室裝修材料中。近年來(lái)，隨著人們生活水平不斷提高，室內(nèi)裝飾成為時(shí)尚，室內(nèi)空氣苯和甲醛污染狀況日益嚴(yán)重。由于人的大部分時(shí)間是在室內(nèi)度過(guò)，因此其對(duì)人體健康的危害不容忽視。苯和甲醛導(dǎo)致妊娠失敗、出生缺陷和嬰兒死亡等妊娠結(jié)局的不良影響已引起廣泛關(guān)注。已有流行病學(xué)研究表明，苯或甲醛單獨(dú)暴露對(duì)女性月經(jīng)周期和生殖機(jī)能具有一定影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，苯或甲醛均具有一定的胚胎毒性。居室裝修后室內(nèi)環(huán)

2、境中苯和甲醛等污染物常同時(shí)存在，但目前尚缺乏其聯(lián)合暴露時(shí)對(duì)胚胎發(fā)育影響的研究報(bào)道。此外，不同生殖階段暴露于苯或甲醛所引起的胚胎毒性效應(yīng)及其反應(yīng)程度可能存在一定差異。本研究采用析因設(shè)計(jì)安排苯和甲醛聯(lián)合暴露劑量，在小鼠卵泡發(fā)育期和胚胎植入期不同生殖階段染毒，探討其胚胎毒性。 研究目的： 探討小鼠卵泡發(fā)育期和胚胎植入期苯與甲醛聯(lián)合暴露對(duì)胚胎植入與植入后胚胎發(fā)育的影響及可能存在的聯(lián)合毒性；比較不同生殖階段暴露于環(huán)境毒物致胚胎毒性

3、的敏感生殖階段階段；通過(guò)檢測(cè)小鼠卵巢組織細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)程度進(jìn)一步觀察胚胎植入障礙卵巢與DNA損傷程度之間的關(guān)系，為居室裝修后室內(nèi)環(huán)境污染物的生殖毒性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.建立卵泡發(fā)育期和胚胎植入期苯與甲醛聯(lián)合暴露致小鼠胚胎毒性的動(dòng)物模型 （1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用兩因素四水平的析因設(shè)計(jì)方法安排動(dòng)物暴露劑量組合。苯和甲醛是其中兩個(gè)研究因素，各設(shè)四個(gè)劑量水平，分別為（0、0.875、8.75、87.5）

4、mg/kg和（0、7.875、15.75、31.5）mg/kg。 （2）暴露設(shè)計(jì)：暴露時(shí)間：卵泡發(fā)育期暴露是在小鼠交配前3d連續(xù)染毒，胚胎植入期暴露是在孕4d-6d連續(xù)染毒。按照設(shè)計(jì)劑量1次/d，連續(xù)3d。暴露方式：經(jīng)腹腔注射染毒。根據(jù)孕鼠染毒當(dāng)天體重調(diào)整苯和甲醛用量。 （3）促排卵處理：雌性小鼠腹腔注射10U孕馬血清（PMSG），48h后腹腔注射10U人絨毛膜促性腺激素（HCG），按雌雄1：1交配合籠，次日檢查陰栓。查到陰

5、栓日作為孕第1天記為D1，連續(xù)三天合籠無(wú)陰栓者棄之。 （4）觀察指標(biāo)：小鼠孕期體重；D9小鼠肝、脾、腎、子宮、卵巢重量；植入胚胎數(shù)目，植入胚胎總重量。 （5）分析方法：SPSS13.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)；首先對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊性時(shí)，進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的F檢驗(yàn)；方差不齊性時(shí)，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05。 2.卵巢組織細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn) 分離和裂解卵巢組織細(xì)胞，KCL-SDS沉淀法

6、分離組織細(xì)胞中游離DNA和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）中的DNA。加入熒光染料Hoechst33258，陰暗處反應(yīng)后采用F-4500型熒光分光光度儀在350nm激發(fā)光和450nm發(fā)射光下測(cè)定各樣品熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量交聯(lián)DNA和自由DNA，計(jì)算DPC系數(shù)。DPC系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析方法同前。 3.胚胎植入障礙與卵巢組織細(xì)胞損傷之間的關(guān)聯(lián)性分析 采用Spss13.0軟件包綜合分析苯與甲醛聯(lián)合暴露后對(duì)卵巢組織細(xì)胞DPC、卵巢重量

7、及胚胎植入數(shù)目的影響，采用pearson相關(guān)計(jì)算DPC與卵巢重量、胚胎植入數(shù)目間的相關(guān)系數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05。 研究結(jié)果： 1.小鼠卵泡發(fā)育期和胚胎植入期苯與甲醛聯(lián)合暴露的胚胎毒性 （1）卵泡發(fā)育期暴露組，甲醛明顯減少胚胎植入數(shù)目和植入胚胎總重量（P分別為0.02和0.00），小鼠卵巢和子宮重量明顯下降（P分別為0.00和0.05）；各劑量苯暴露組未顯示明顯的胚胎和母體毒性（P均大于0.05）；苯和甲

8、醛聯(lián)合暴露時(shí)，對(duì)卵巢重量的影響有明顯聯(lián)合作用（F=2.17，P=0.02）。 （2）胚胎植入期暴露組，苯或甲醛對(duì)小鼠胚胎植入數(shù)目、植入胚胎總重量、胚胎均重均無(wú)明顯影響；也未見對(duì)小鼠卵巢和子宮重量的影響，但脾臟和腎臟重量變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.05）。 （3）共同暴露時(shí)苯和甲醛的聯(lián)合作用：卵泡發(fā)育期，與單一甲醛暴露比較，低、中劑量的苯和高劑量甲醛聯(lián)合暴露時(shí)，胚胎植入數(shù)目和每窩胚胎總重量呈現(xiàn)出一定的聯(lián)合作用；在胚胎植入

9、期，與單一甲醛暴露時(shí)比較，中、高劑量苯和甲醛聯(lián)合暴露時(shí)，胚胎植入數(shù)目和每窩胚胎總重量呈現(xiàn)出一定的聯(lián)合作用。 2.卵巢組織細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián) （1）卵泡發(fā)育期暴露，苯對(duì)小鼠卵巢組織細(xì)胞DPC系數(shù)無(wú)明顯影響（P=0.14）；甲醛對(duì)小鼠卵巢組織細(xì)胞DPC系數(shù)有明顯影響（P=0.00），低劑量、中劑量和高劑量與組內(nèi)對(duì)照比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值分別為-3.93、-4.85、-4.54，P值分別為0.00，0.00，0.00）。

10、 （2）胚胎植入期暴露，苯對(duì)小鼠卵巢組織細(xì)胞DPC系數(shù)無(wú)明顯影響（P=0.721）；各劑量甲醛對(duì)小鼠DPC系數(shù)影響也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.127）。 （3）卵泡發(fā)育期暴露于苯和甲醛，對(duì)卵巢組織細(xì)胞DPC系數(shù)影響存在聯(lián)合作用（F=39.87，P=0.00*）。 3.胚胎植入障礙與卵巢組織細(xì)胞損傷之間的關(guān)聯(lián)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，卵泡發(fā)育期暴露于甲醛，卵巢組織細(xì)胞DPC系數(shù)與卵巢重量之間存在明顯的負(fù)相

11、關(guān)關(guān)系（r=-0.514，P=0.000）；與胚胎植入數(shù)目之間也存在一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.236，P=0.060）。 結(jié)論： 1.卵泡發(fā)育期暴露于甲醛導(dǎo)致胚胎植入數(shù)目減少、植入胚胎總重量減輕；表明在小鼠卵泡發(fā)育期甲醛暴露可導(dǎo)致明顯的胚胎毒性； 2.卵泡發(fā)育期或胚胎植入期暴露于苯對(duì)小鼠胚胎植入數(shù)目、植入胚胎總重量、胚胎均重等的毒性作用較?。?3.卵泡發(fā)育期或胚胎植入期暴露于苯和甲醛其胚胎毒性均存在