胚胎植入期暴露二硫化碳致小鼠胚胎植入障礙與母體免疫耐受損傷關(guān)系的研究.pdf

1、背景：二硫化碳(Carbon disulfide，CS2)是一種工業(yè)上廣泛應(yīng)用的有機(jī)溶劑同時(shí)也是重要的化工原料，主要應(yīng)用于粘膠纖維的生產(chǎn)，以及玻璃紙制造、橡膠硫化、谷物熏蒸、衣物去漬劑、石油精制、清漆和石蠟溶解等。在生產(chǎn)過(guò)程中，CS2常因其易揮發(fā)性而擴(kuò)散在工作環(huán)境中，對(duì)暴露在其中的工人造成多器官損害。我國(guó)是世界上最大的粘膠纖維生產(chǎn)基地，該行業(yè)屬于勞動(dòng)密集型行業(yè)，從業(yè)人數(shù)眾多，特別是在長(zhǎng)絲和短絲的紡絲車(chē)間女工占相當(dāng)大的比例。CS2是一種多

2、系統(tǒng)毒物，對(duì)神經(jīng)、心血管、生殖、肝臟、腎臟等均有毒性作用。關(guān)于CS2生殖毒性的研究發(fā)現(xiàn)，暴露CS2可導(dǎo)致男工性功能下降，睪丸萎縮，精子數(shù)目減少、活動(dòng)力下降和畸形精子率增加；女工多見(jiàn)月經(jīng)周期異常、痛經(jīng)、經(jīng)期延長(zhǎng)、血量增多，嚴(yán)重者可引起自然流產(chǎn)、死胎死產(chǎn)等現(xiàn)象。本課題組采用前瞻性研究對(duì)欲生育的CS2作業(yè)女工進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CS2作業(yè)女工受孕時(shí)間延長(zhǎng)，使其獲得一次臨床可識(shí)別妊娠的概率明顯降低；通過(guò)檢測(cè)欲生育女工尿樣中絨毛膜上皮激素含量發(fā)現(xiàn)早早孕

3、丟失率明顯增加，有近半數(shù)受精卵因不能正常著床而丟失。但其胚胎毒性作用機(jī)制尚不明確。許多研究表明，母體對(duì)胚胎的免疫耐受是維持正常妊娠的關(guān)鍵，其中淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子起重要作用，但關(guān)于CS2暴露致母胎免疫耐受損傷的研究報(bào)道較少，并且尚缺少用于篩選和評(píng)價(jià)早期生殖損傷效應(yīng)的敏感觀察指標(biāo)。解決以上問(wèn)題可為職業(yè)性CS2暴露女工勞動(dòng)保護(hù)措施的修訂和實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)。
　　 目的：探討母胎免疫耐受狀況與胚胎植入之間的關(guān)系，揭示胚胎植入期C

4、S2暴露致胚胎毒性作用機(jī)理，為CS2暴露女工職業(yè)勞動(dòng)保護(hù)措施的修訂和實(shí)施提供理論依據(jù)。①胚胎植入期孕鼠暴露于不同劑量CS2以及胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2，觀察母體毒性和胚胎毒性。②胚胎植入期孕鼠暴露于不同劑量CS2以及不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞DNA損傷情況。③胚胎植入期孕鼠于不同胚胎植入時(shí)間點(diǎn)暴露CS2，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)孕鼠子宮組織中Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和

5、Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10表達(dá)水平。
　　 方法：⑴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)8-12w性成熟昆明種(KM)小鼠，雌性體重為28-32g;同種雄性單籠飼養(yǎng)，雄性36-40g。按雌雄1∶1合籠，次日檢查陰栓，陰栓陽(yáng)性日為孕1d，記為GD1。受孕后按體重隨機(jī)分組。⑵促排卵處理：腹腔注射10u PMSG，48h后腹腔注射10u HCG。⑶CS2暴露劑量分為低、中、高三個(gè)水平，分別為157.8mg/kg(0.1LD50)、315.7

6、mg/kg CS2(0.2LD50)和631.4mg/kg CS2(0.4LD50);⑷分別于孕第三天(GD3)、GD4、GD5、GD6不同胚胎植入時(shí)間點(diǎn)暴露，并分別以GD4、GD5、GD6、GD7、GD9作為觀察終點(diǎn)終止實(shí)驗(yàn)；⑸各組動(dòng)物以設(shè)計(jì)的暴露劑量和暴露時(shí)間進(jìn)行染毒處理。各組孕鼠于GD9脫臼處死，計(jì)數(shù)胚胎植入數(shù)目并稱(chēng)取肝臟、脾臟、腎臟、卵巢、窩重、子宮和胚泡凈重量。⑹SCGE技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA損傷實(shí)驗(yàn)：各組孕鼠暴露于CS224

7、h后脫臼處死，提取脾臟淋巴單細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞活性率，用SCGE方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA損傷。⑺ELISA法檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)：各組孕鼠于設(shè)計(jì)的各觀察終點(diǎn)脫臼處死，取子宮制備組織蛋白勻漿，用BCA法測(cè)定勻漿樣品中的總蛋白量；ELISA方法檢測(cè)子宮組織中Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ以及Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10的含量。⑻采用SPSS16.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)量指標(biāo)以(-x)±s表示。各組之間指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn);若

8、組間方差齊，采用單因素方差分析(ONE-WAYANOVA)進(jìn)行F檢驗(yàn)，差異有顯著性時(shí)采用Dunnett t test進(jìn)行暴露組與對(duì)照組均數(shù)差異的顯著性檢驗(yàn)；若組間方差不齊，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Kruskal-Wallis Test進(jìn)行組間比較，Mann-Whitney Test進(jìn)行兩兩比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05。
　　 結(jié)果：①胚胎植入期暴露于不同劑量CS2，高劑量暴露組的胚胎植入數(shù)目、宮胚窩重和胚胎窩重與對(duì)照比較差異均有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），平均植入數(shù)目較對(duì)照組減少了79.03％，宮胚窩重和胚胎窩重分別減少了75.53％和90.67％，但校正胚胎植入數(shù)目后胚胎均重與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2，GD4和GD5暴露組的胚胎植入數(shù)目和胚胎窩重與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，GD4和GD5暴露組的胚胎植入數(shù)目較對(duì)照組分別減少了93.65％和90.44％，胚胎窩重也明顯低于對(duì)照組，但校正胚胎

10、植入數(shù)目后胚胎均重與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。母體毒性：胚胎植入期不同劑量、不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2，孕鼠體重增重和肝臟、脾臟等指標(biāo)與對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③胚胎植入期暴露于不同劑量CS2，彗星頭部和彗星尾部DNA含量(HDNA％和TDNA％)、彗星尾長(zhǎng)(TL)、彗星全長(zhǎng)(CL)、彗星尾矩(TM)、Olive尾矩(OTM)各項(xiàng)指標(biāo)，高劑量和中劑量暴露組與對(duì)照組和低劑量暴露組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

11、④胚胎植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS2，GD4、GD5和GD6暴露組的各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。⑤Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ表達(dá)水平：與對(duì)照組相比，GD3暴露組的GD5觀察終點(diǎn)和GD4暴露組的GD5、GD9觀察終點(diǎn)IL-2表達(dá)水平明顯增加；GD4暴露組的GD7、GD9觀察終點(diǎn)IFN-γ表達(dá)水平明顯增加（P值均小于0.05）；⑥Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10表達(dá)水平：與對(duì)照組相比，GD3暴露組的GD

12、4觀察終點(diǎn)IL-4表達(dá)水平明顯降低；GD5暴露組的GD6觀察終點(diǎn)IL-10表達(dá)水平明顯降低；各暴露組的GD9觀察終點(diǎn)IL-4和IL-10表達(dá)水平均明顯降低（P值均小于0.05）；⑦Th1和Th2各細(xì)胞因子比值中多項(xiàng)比值在各暴露組的各觀察終點(diǎn)與對(duì)照組比較均見(jiàn)明顯增加。
　　 結(jié)論：⑴胚胎植入期暴露于CS2可導(dǎo)致明顯的胚胎毒性，表現(xiàn)為高劑量CS2暴露明顯減少胚胎植入數(shù)目，是CS2毒性的敏感劑量；GD4和GD5暴露于CS2致胚胎植入數(shù)

13、目明顯減少，是胚胎植入期CS2毒性作用的敏感時(shí)間點(diǎn)。⑵胚胎植入期暴露于CS2可導(dǎo)致母體脾臟淋巴細(xì)胞DNA損傷，并且損傷程度隨著暴露劑量的增加而相應(yīng)增加。提示胚胎植入期暴露于CS2可能通過(guò)損傷淋巴細(xì)胞而影響母體對(duì)胚胎的免疫耐受，從而導(dǎo)致胚胎植入障礙。⑶胚胎植入期暴露于CS2可影響母體子宮組織中Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平，抑制母體對(duì)胚胎形成以Th2為主的免疫應(yīng)答。以上研究結(jié)果表明，胚胎植入期暴露于CS2可損傷母體淋巴細(xì)胞的正常功能，造成