槲皮素對(duì)LPS致小鼠胚胎著床障礙及子宮損傷的保護(hù)作用.pdf

1、LPS是革蘭氏染色陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分之一。在妊娠早期，動(dòng)物接觸LPS可以引發(fā)多種不良結(jié)局，如胚胎吸收或死胎以及自發(fā)性流產(chǎn)等等。研究證實(shí)，槲皮素(Quercetin)具有多種藥理作用，比如抗炎作用、抗氧化及清除氧自由基的作用，此外還有免疫調(diào)節(jié)的功效。因此，槲皮素可以有效地對(duì)抗LPS對(duì)子宮造成的損害。本試驗(yàn)首先篩選出LPS致小鼠胚胎著床障礙的最佳劑量，然后通過(guò)LPS構(gòu)建小鼠胚胎著床障礙的模型，ELISA和RT-PCR法分別檢測(cè)小鼠血清

2、及子宮組織中IL-10和TNF-α的含量及其mRNA的表達(dá)，運(yùn)用Western blotting和RT-PCR方法分別檢測(cè)小鼠子宮組織中TLR4/NF-κB蛋白及其mRNA的表達(dá)，研究槲皮素對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠子宮組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　選取未經(jīng)產(chǎn)的雌性昆明小鼠60只，經(jīng)正常飼養(yǎng)7d后與雄性小鼠交換墊料，用無(wú)菌棉簽蘸取小鼠陰道黏液做成涂片在顯微鏡下觀察，進(jìn)行發(fā)情鑒定。確定發(fā)情的

3、母鼠與公鼠1∶1合籠過(guò)夜，第二天清晨進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)陰栓的小鼠則定為懷孕0d。將懷孕母鼠隨機(jī)分為6組（10只/組），分別為對(duì)照組和5個(gè)不同劑量的LPS組。于孕4d、5d對(duì)照組小鼠尾靜脈注射PBS，其余各組分別尾靜脈注射0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和5.0μg/ml的LPS。孕6d剖檢，觀察子宮生長(zhǎng)情況，從著床胚胎數(shù)和子宮重量?jī)蓚€(gè)方面分析確定胚胎著床障礙模型的最佳劑量。
　　結(jié)果顯示，不同濃度

4、的LPS可以不同程度地阻礙小鼠胚胎著床，使胚胎著床數(shù)減少。隨著LPS濃度的增加，各組小鼠子宮明顯變小，床數(shù)胚胎數(shù)、子宮重量均有所降低，其中LPS濃度為0.2μg/ml和0.5μg/ml組的著床胚胎數(shù)、子宮重量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2.0μg/ml和5.0μg/ml LPS組小鼠胚胎著床數(shù)太低，不適合用于以后的試驗(yàn)，而1.0μg/ml LPS組平均胚胎著床數(shù)、子宮重量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，又不至于太低，因此，1.0μg/ml

5、的LPS濃度可以作為小鼠胚胎著床障礙模型的最佳劑量。
　　將50只懷孕母鼠隨機(jī)分為5組（10只/組），分別為對(duì)照組、模型組和3個(gè)不同劑量的槲皮素組。在小鼠懷孕1-3 d時(shí)，對(duì)照組和模型組灌服生理鹽水，槲皮素組分別灌服0.25、1.25、2.5 mg/ml的槲皮素，在小鼠懷孕4d、5d時(shí)，模型組和各槲皮素組分別尾靜脈注射LPS，對(duì)照組尾靜脈注射PBS。HE染色觀察子宮病理學(xué)變化，ELISA和RT-PCR方法檢測(cè)IL-10和TNF-α

6、含量及其mRNA的表達(dá)，Westernblotting和RT-PCR方法檢測(cè)NF-κB和TLR4蛋白的表達(dá)量及其mRNA的表達(dá)。子宮組織病理結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮組織結(jié)構(gòu)損傷有明顯的改善作用，2.5 mg/ml的槲皮素組與模型組比較有顯著改善;ELISA的試驗(yàn)結(jié)果表明:LPS使小鼠血清中IL-10的含量下降，TNF-α的含量上升，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，使免疫調(diào)節(jié)向著有害于妊娠的Th1方向進(jìn)行，但是造模前事先灌服了槲皮素后，

7、小鼠血清中IL-10的含量明顯升高，TNF-α的含量也降了下來(lái)，有效地控制了炎癥反應(yīng)，并且與RT-PCR的結(jié)果保持一致;Western blotting結(jié)果表明，LPS能有效增加小鼠子宮內(nèi)胞漿TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表達(dá)量;0.25 mg/ml的槲皮素作用后，小鼠子宮內(nèi)胞漿TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表達(dá)與模型組沒(méi)有顯著差別;1.25mg/ml的槲皮素作用后，小鼠子宮內(nèi)胞漿TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表達(dá)低于模型組

8、;2.5 mg/ml槲皮素作用后，小鼠子宮內(nèi)胞漿TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表達(dá)顯著地低于模型組，隨著槲皮素劑量的增加，胞漿TLR4蛋白和胞核NF-κB蛋白的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性降低;RT-PCR結(jié)果顯示，LPS作用后小鼠子宮中TLR4mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)豐度與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05);與模型組相比槲皮素各處理組TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，且隨著槲皮素濃度的升高

9、其相對(duì)表達(dá)呈劑量依賴(lài)性。
　　氧化指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中SOD和GSH-PX的活性分別降低了30.10％和38.94％，MDA和NO的水平升高了29.96％及42.44％，而槲皮素處理組的水平都逐漸恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明槲皮素可抑制脂多糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，具有抗氧化作用。
　　結(jié)論:LPS可以阻礙小鼠胚胎著床并引起子宮組織受損，使Th1/Th2免疫平衡向不利妊娠的Th1方向進(jìn)行;使TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激