谷維素與黃連素聯(lián)合應(yīng)用的藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)顯示高膽固醇血癥占心血管疾病的56％，每年均有4.4百萬(wàn)人死于高膽固醇血癥。
　　 目前用于調(diào)脂的藥物有他汀類（即HMG-CoA還原酶抑制劑）、貝特類、煙酸、膽酸脂螯合劑等四大類，其中臨床實(shí)際應(yīng)用最多的主要是他汀類和貝特類，但大劑量應(yīng)用他汀類可使肝轉(zhuǎn)氨酶升高、肌痛及肌炎，若與貝特類藥物聯(lián)合應(yīng)用更可能引起嚴(yán)重的肌炎及橫紋肌溶解，甚至發(fā)生急性腎功能衰竭;單獨(dú)應(yīng)用貝特類藥物容易引起胃腸道不適及偶見皮膚瘙癢、蕁

2、麻疹、皮疹、脫發(fā)、頭痛、失眠和性欲減退等，長(zhǎng)期服用可導(dǎo)致肝、腎功能損害。其次，上述兩種藥物價(jià)格昂貴，對(duì)于需要長(zhǎng)期服藥的患者而言無(wú)疑是一種嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研發(fā)一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的降脂藥具有重要意義。
　　 黃連素(Berberine，BBR)常用于腸道感染;谷維素(Oryzanol，OZ)主要改善自主神經(jīng)功能，可減少內(nèi)分泌紊亂，改善精神神經(jīng)失調(diào)癥狀。臨床及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明兩者均有顯著降血脂作用且臨床應(yīng)用安全有效。BBR與目前

3、臨床上使用的調(diào)脂類藥物作用機(jī)理明顯不同，它是在基因轉(zhuǎn)錄后水平上，通過(guò)作用于3'UTR區(qū)域，穩(wěn)定及增加低密度脂蛋白受體的mRNA并提高其受體蛋白，提高密度脂蛋白的代謝從而達(dá)到降低血脂的目的。OZ則通過(guò)抑制體內(nèi)過(guò)氧化脂的產(chǎn)生、改變膽固醇酯酶和酰基輔酶的活力，降低膽固醇合成，增加膽固醇和膽酸排除，最終降低血脂濃度。雖然兩者降脂機(jī)制不同，但合用后具有明顯的協(xié)同作用，可降低各自的用藥劑量，減輕長(zhǎng)期用藥帶來(lái)的毒副作用，同時(shí)OZ可以促進(jìn)BBR的吸收，

4、提高BBR生物利用度。
　　 因此，本課題以BBR與OZ為研究對(duì)象，運(yùn)用紫外分光光度法、液質(zhì)聯(lián)用等方法進(jìn)行藥學(xué)、藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)方面的系列研究。首先擬建立一種簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、可靠的含量測(cè)定方法同時(shí)測(cè)定BBR及OZ的含量，為后期制劑研發(fā)提供質(zhì)控方法。同時(shí)建立高血脂動(dòng)物模型研究BBR與OZ聯(lián)用的降脂效果，結(jié)合藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)考察比較BBR、OZ單獨(dú)與聯(lián)合使用后在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程的變化，從藥動(dòng)學(xué)層面探討B(tài)BR與OZ產(chǎn)生協(xié)同降脂作用的機(jī)理。另

5、外，由于OZ溶解度低，吸收差，生物利用度(BA)低，本課題亦分別從體外及體內(nèi)考察吐溫-80(TW-80)對(duì)OZ的增溶作用，為提高OZ生物利用度提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:1.含量測(cè)定。初步建立BBR與OZ的含量測(cè)定方法，為后期制劑的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 2.藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。建立高血脂大鼠模型，篩查BBR與OZ合用后降脂效果的最佳處方。
　　 3.藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，考察比較BBR、OZ單用與合用后在大

6、鼠體內(nèi)的吸收、分布、消除等參數(shù)的變化情況，探討B(tài)BR與OZ的協(xié)同作用機(jī)理，從藥動(dòng)學(xué)角度闡明兩藥合用后協(xié)同降脂的作用機(jī)制。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)考察TW-80對(duì)OZ的增溶作用。
　　 方法:1.參考《中國(guó)藥典》2010版、衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，采用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法同時(shí)測(cè)定BBR及OZ含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。實(shí)驗(yàn)選定OZ的測(cè)定波長(zhǎng)為304nm，參比波長(zhǎng)為369nm，BBR的測(cè)定波長(zhǎng)為430n

7、m;通過(guò)BBR、OZ對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兩藥的含量。
　　 2.藥效學(xué)實(shí)驗(yàn):建立高血脂大鼠模型及降脂效果考察
　　 96只Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)取8只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料，其余大鼠給予高脂飼料，4周后通過(guò)眼眶取血，檢測(cè)血清生化指標(biāo)(總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)，根據(jù)血清TC值將大鼠隨機(jī)分為高血脂模型組（高脂飼料）、陽(yáng)性對(duì)照組（高脂飼

8、料+洛伐他汀組）及BBR單藥Ⅰ(0.01 g·kg-1)、BBRⅡ(0.03 g·kg-1)、BBRⅢ(0.1 g·kg-1)，OZ單藥Ⅰ(0.01 g·kg-1)、OZⅡ(0.03 g·kg-1)、OZⅢ(0.1 g·kg-1)、復(fù)方Ⅰ組(BBR0.025 g·kg-1+OZ0.005 g·kg-1)，復(fù)方Ⅱ組(BBR0.02 g·kg-1+OZ0.01 g·kg-1)、復(fù)方Ⅲ組(BBR0.015 g·kg-1+OZ0.015 g·k

9、g-1)。高血脂模型組及正常對(duì)照組每天灌胃(ig)給予生理鹽水，其余各組連續(xù)給藥4周，收集血清分別檢測(cè)TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，考察BBR、OZ單用及聯(lián)用后的降脂效果。
　　 3.藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　 取正常SD大鼠24只，體重(250-320g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，禁食12h，自由飲水，隨機(jī)分為4組，雌雄各半，分別以100 mg·kg-1(0.5％CMC-Na混懸)灌胃量給予大鼠OZ及BBR+OZ、TW-80

10、+OZ2，5，10，20，30，60，120，180，240，360，480及720 min后，給予BBR5，10，20，30，60，120，180，240，360，480，720及1440 min后，進(jìn)行眼底靜脈叢取血(400μL)，肝素鈉抗凝，4000 r·min-14℃離心10min，精密量取100μL上清血漿置另一EP管中，-80℃冰箱保存待測(cè)。血樣經(jīng)過(guò)前處理后，采用液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS/MS)儀測(cè)定血漿中BBR與阿魏酸(Fem

11、lic，F(xiàn)A)的含量。測(cè)定結(jié)果用DAS2.0軟件進(jìn)行分析，以擬合度和AIC值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇適當(dāng)?shù)姆渴夷Ｐ?，?jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。
　　 稱取適量OZ，體外采用0.1 mol·L-1 HC1、pH6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)以模擬胃液與腸液。用含有不同濃度TW-80的0.1 mol·L-1 HCl或PBS溶解，紫外分光光度計(jì)(UV-Vis)測(cè)定OZ在329nm波長(zhǎng)處的吸光度，通過(guò)吸光度的變

12、化考察TW-80對(duì)OZ的增溶效果。體內(nèi)通過(guò)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)考察添加TW-80后OZ的藥動(dòng)學(xué)變化，從藥動(dòng)學(xué)角度考察TW-80對(duì)OZ的增溶效果。
　　 結(jié)果:1.含量測(cè)定方法的測(cè)定
　　 OZ和BBR的線性范圍和相關(guān)系數(shù)分別為2.93～52.8 mg·L-1，R2=0.9999;2.1～37.8mg·L-1，R2=1.0000。對(duì)應(yīng)的平均回收率和RSD為98.69％，2.36％(n=6);101.79％，2.01％（n=6）。

13、r>　　 2.藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，高血脂大鼠模型的建立及降脂效果考察
　　 給予Wistar雄性大鼠高脂飼料4周，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，建立高血脂大鼠模型:與空白對(duì)照組比較，高血脂模型組中TC、LDL-C均顯著升高(P＜0.05），而HDL-C/TC(H/T)比值顯著降低(P＜0.05），模型復(fù)制成功;后給藥4周，檢測(cè)各項(xiàng)血脂指標(biāo)，觀察藥物降脂效果:單藥Ⅱ、Ⅲ組，用藥前后對(duì)比，各指標(biāo)均有明

14、顯改善，但Ⅱ與Ⅲ組之間的療效并無(wú)顯著差異。因此，綜合分析，BBRⅡ、OZⅡ的劑量最為合適，既有明顯療效，同時(shí)劑量相對(duì)較小。三種復(fù)方降脂藥均有療效，且效果相近;復(fù)方各組與單藥Ⅱ組及陽(yáng)性組比較，療效雖無(wú)明顯差異，但從藥量分析，復(fù)方中各單藥用量比單藥組低，理論上降低毒副作用。復(fù)方Ⅰ中，BBR為單藥劑量5/6，OZ為1/6;復(fù)方Ⅱ中，將兩藥降至單藥劑量的一半;復(fù)方Ⅲ中BBR僅為單藥劑量的1/3，OZ為2/3。三組復(fù)方具有較好的療效。
　　

15、 3.藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　 在電噴霧離子源ESI(-)及ESI(+)離子化條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式分別檢測(cè)FA(m/z193-＞134)及BBR(m/z336-＞292)。FA在3.082-400.32 ng·mL-1范圍內(nèi)(R2=0.9957)、BBR在5.008-127.2 ng·mL-1范圍內(nèi)(R2=0.9981)呈良好線性關(guān)系?？诜o藥后，BBR及OZ在大鼠體內(nèi)符合二室開放模型;單用和配伍給藥后，各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均

16、具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩者配伍給藥后，F(xiàn)A t1/2β值(399.61+85.67)，Cmax值(285.65±57.16)及AUC0-∞值(79803.02±5757.05)均顯著高于單藥組中t1/2β值(197.74±54.84)， Cmax值(166.93±54.70)及AUC0-∞值(40420.60±15773.44);相應(yīng)的，BBR的Cmax值(66.90±18.49)及AUC0-∞值(26606.41±3897.89)均高于

17、單藥組中Cmax值(65.99±13.34)及AUC0-t值(19197.90±2763.47)，但t1/2β值(351.80±71.35)低于單藥組中t1/2β值(561.42±97.19)。表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用后，F(xiàn)A分布加快，消除減慢，吸收增加，生物利用度提高;BBR分布減慢，消除加快，吸收增加，生物利用度提高。
　　 4.OZ增溶作用初步研究
　　 體外TW-80對(duì)OZ的增溶作用呈濃度依賴性(TW-80濃度為0～1％

18、)。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加TW-80后，雖然FA的吸收并無(wú)提高，但Tmax延長(zhǎng)、AUC0-∞顯著升高，提示TW-80能延長(zhǎng)OZ的吸收及分布，提高OZ的生物利用度。
　　 結(jié)論:雙波長(zhǎng)紫外分光光度法可同時(shí)測(cè)定BBR與OZ含量的測(cè)定及其質(zhì)量控制方法。通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)證明BBR聯(lián)合OZ可產(chǎn)生明顯的協(xié)同降脂作用，兩藥合用可減少BBR與OZ的用量，從理論上減少了大劑量單藥帶來(lái)的副作用。為進(jìn)一步研究BBR與OZ合用協(xié)同降脂的作用機(jī)制，通過(guò)