熒光素酶生物發(fā)光法快速評(píng)價(jià)消毒效果的初步研究.pdf

1、傳統(tǒng)的消毒評(píng)價(jià)方法是將消毒后樣本接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，從而定性或定量評(píng)價(jià)消毒效果。此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往影響后續(xù)工作的開展。因此，尋找快速的評(píng)價(jià)方法一直是研究人員工作的方向。本課題擬通過熒光素酶催化的生物發(fā)光反應(yīng)，達(dá)到快速評(píng)價(jià)消毒效果的目的。 熒光素酶在基因工程實(shí)驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用，特別是作為報(bào)告基因，對(duì)研究基因活性、基因定位、空間表達(dá)等有重要意義。熒光素酶可催化如下生化反應(yīng)：Luciferase，Mg2+Lucife

2、rin+ATP+02→Oxyluciferin+AMP+pp~+COz+Light在此酶促反應(yīng)中，保證反應(yīng)物過量，則反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量就與熒光素酶活性成比例，在一定條件下即可認(rèn)為與熒光素酶的量成比例。 本課題首先改構(gòu)大腸桿菌，使其表達(dá)熒光素酶。通過裂解細(xì)菌，加入過量熒光素底物，利用細(xì)菌細(xì)胞中的ATP，發(fā)生上述酶促反應(yīng)產(chǎn)生熒光。然后利用熒光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行定量，從而定量熒光素酶，進(jìn)而反映細(xì)菌含量，達(dá)到評(píng)價(jià)消毒效果的目的。主

3、要結(jié)果總結(jié)如下： 1大腸桿菌的重組與鑒定 (1)用CaCl2制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用含有熒光素酶基因(1uc+)的pGL3-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的重組大腸桿菌。挑選形態(tài)和大小典型的菌落，用抗生素陽性培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖后低溫冷凍保存。 (2)從重組大腸桿菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，證明有與pGL3一Control質(zhì)粒相同大小的DNA條帶產(chǎn)生。進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切分析，PCR擴(kuò)增，

4、測(cè)序分析，結(jié)果均證明pgL3-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(8099)成功，所制備的重組大腸桿菌中含有pGL3-Control質(zhì)粒。 (3)對(duì)保存的7株重組大腸桿菌復(fù)蘇、培養(yǎng)后，用熒光光度計(jì)初步測(cè)定了重糾大腸桿菌的棚對(duì)發(fā)光值(RLU)。選擇在相同菌量前提下相對(duì)發(fā)光值高的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2生物發(fā)光法評(píng)價(jià)消毒效果的研究 (1)由于受細(xì)菌培養(yǎng)、熒光素酶表達(dá)量和熒光光度計(jì)靈敏度的限制，我們確定了在菌液濃度為

5、l×108cfu／ml一1×109cfu／ml時(shí)，各科實(shí)驗(yàn)消毒劑及紫外線對(duì)幣紺人腸桿菌的殺火率達(dá)到99．9％f忖的殺菌劑量，并川此劑暈：進(jìn)行懸液定量殺滅實(shí)驗(yàn)，以使實(shí)驗(yàn)后樣本可同時(shí)進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)和熒光測(cè)定分析。 用棚同劑黽：的消毒劑及紫外線作用于重組人腸桿菌和人腸桿菌(8099)，發(fā)現(xiàn)重組火腸桿菌除對(duì)二氯異氰尿酸鈉的抗力增強(qiáng)外，對(duì)紫外線、戊二醛、過氧乙酸和碘伏的抗力與大腸桿菌(8099)相比沒有明顯變化。 (2)確定菌量

6、與RLU之問的關(guān)系。按照優(yōu)化的試驗(yàn)程序利用TD20／2()熒光光度計(jì)對(duì)系列稀釋度的重組大腸桿菌的RIU進(jìn)行測(cè)定，川時(shí)選擇適宜稀釋度進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。將二者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)菌量存l×104cfu／ml一1×1010cru／m】范圍內(nèi)時(shí)，菌量對(duì)數(shù)值與RLU的對(duì)數(shù)值呈直線天系(R2=0．9982，p

7、應(yīng)的菌量與活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法得到的菌量…致，說明可以用牛物發(fā)光法評(píng)價(jià)碘伏對(duì)重組大腸桿菌的殺滅效果。 測(cè)定戊二醛、過氧乙酸、二氯異氰尿酸鈉作用后樣本的RLU，其所對(duì)應(yīng)的菌量高出活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法得到的菌量卜2個(gè)數(shù)量級(jí)，但RLU大小變化與作用劑量變化一致，說明生物發(fā)光法可以部分反映殺菌效果。 測(cè)定紫外線作用后樣本的RLU，其大小變化有規(guī)律，但總體范圍與消毒作用前RLU相比無明顯下降。 采用的生物發(fā)光法評(píng)價(jià)消毒效果省卻了對(duì)人腸