血管內(nèi)皮生長因子-C在白血病發(fā)病機制中作用的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、本研究旨在基礎(chǔ)和臨床兩方面對VEGF-C的功能作進一步探討。通過在體外構(gòu)建VEGF-C的真核細胞表達載體；體外細胞模型實驗和裸鼠模型體內(nèi)實驗來探索VEGF-C是否通過VEGFR-2，3途徑影響白血病細胞增殖、存活及耐藥等生物學(xué)性狀；同時檢測VEGF-C及其受體在慢性粒細胞性白血病臨床標(biāo)本的表達并初步探討其意義。 1.VEGF-C真核表達載體的構(gòu)建及蛋白表達。 為研究VEGF-C蛋白在血液腫瘤細胞中的作用奠定基礎(chǔ)，采用RT

2、-PCR檢測本研究所保存的9種白血病細胞株及實體瘤、內(nèi)皮細胞cDNA，發(fā)現(xiàn)血液腫瘤細胞株中NB4，HEL，RPMl82263種細胞株細胞表達VEGFR-3基因，HEL、TF．1為VEGFR-2+細胞株。自行設(shè)計一對VEGF-C引物，RT-PCR從肺癌A549細胞株eDNA中擴增VEGF-C，連接T載體并轉(zhuǎn)化TGI大腸桿菌；雙酶切及測序鑒定并連接到真核表達載體pcDNA3．1／V5-His-TOPO，構(gòu)建成pcDNA3．1／V5-His-

3、TOPO。VEGF-C真核表達載體；轉(zhuǎn)化TGl大腸桿菌擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后4℃保存；將此真核表達載體并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行瞬時表達。RT-PCR從轉(zhuǎn)染pcDNA3．1／VEGF-C的CHO細胞的cDNA中可擴增出756bp大小VEGF-C基因片段，而轉(zhuǎn)空載體的CHO細胞cDNA中未擴增出目的片段。WesternBlotting證實Penta-His抗體及抗VEGF-C的多抗均與CHO細胞上清重組

4、蛋白VEGF-C反應(yīng)，證明轉(zhuǎn)染成功。 2．DcDNA3．1N5-His-TOPO-VEGF-C轉(zhuǎn)染CHO細胞及其生物學(xué)作用。 VEGFs的受體主要表達在血管／淋巴管內(nèi)皮細胞，但近年來研究表明VEGFs的受體也在血液腫瘤細胞表達，但其對白血病細胞的作用尚不清楚。 本研究用脂質(zhì)體法將載有VEGF-CcDNA的真核表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞株，空載體作陰性對照；無血清培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，Westernblotting檢測培養(yǎng)上

5、清VEGF-C并濃縮。利用雞胚絨毛尿囊膜觀察CHONEGF-C細胞培養(yǎng)上清中重組VEGF-C可以誘發(fā)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。RT-PCR和流式細胞術(shù)檢測出9例血液腫瘤細胞株中有4種細胞株表達VEGF-C受體(3種VEGFR-3+，2種VEGFR-2+)。采用噻唑藍(MTT)法檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，重組蛋白VEGF-C不僅可以促進VEGFR-3+白血病細胞(NB4)增殖(P24h=0．006，P48h=0．018)，而對VEGFR-3一的

6、K562細胞則沒有作用。AnnixinV／PI雙染流式細胞術(shù)(FCM)檢測顯示上清中VEGF-C具有抑制化療藥物(Etoposide、DNR、As203)誘導(dǎo)VEGFR-3+陽性白血病細胞株(NB4)誘導(dǎo)的細胞凋亡(P=0．019，0．013，0．042)。結(jié)果提示重組蛋白VEGF-C不僅誘導(dǎo)血管新生，而且可能通過VEGFR-3信號途徑促進白血病細胞增殖及抗凋亡，因此我們推測VEGF-C／VEGFR-3信號途徑可望作為白血病治療的靶點。

7、 3．轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA對NB4細胞增殖、分化與凋亡的影響。 多種腫瘤細胞包括血液腫瘤細胞可以分泌VEGFs。同時近年來研究表明也在血液腫瘤細胞表達VEGFs的受體，因此可能存在VEGFs通過VEGFR以一種自分泌形式影響血液腫瘤細胞的生物學(xué)性狀。 為探討轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA對急性早幼粒細胞白血病細胞株(NB4細胞)增殖、ATRA誘導(dǎo)分化及化療藥介導(dǎo)的細胞凋亡作用的影響，采用脂質(zhì)體法將重組表達載體(pc

8、DNA3．1-VEGF-C)和空質(zhì)粒pcDNA3．1轉(zhuǎn)染NB4細胞建立穩(wěn)定細胞株，并經(jīng)RT-PCR和Westernblotting鑒定其穩(wěn)定表達VEGF-C蛋白。MTT法作生長曲線及集落形成實驗顯示NB4／VEGF-C增殖能力顯著高于NB4/pcDNA3．1細胞。然而，NB4／VEGF-C細胞的生長可以被FLT-4的特異性抑制劑MAZ51抑制。NB4／VEGF-C細胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，涂片染色作形態(tài)學(xué)分析顯示此細胞對抗ATRA介導(dǎo)的早幼

9、粒細胞分化成熟，同時FCM檢測細胞表面的CDllb表達量低于對照組，實時熒光定量PCR檢測出NB4／VEGF-C細胞調(diào)控粒細胞分化基因C／EBP?；蚝績H為對照組的1／32。NB4／VEGF-C細胞經(jīng)VP．16介導(dǎo)48h后AnnexinV／PI-FCM分析得出凋亡百分率(7．20-~2．52％)明顯低于NB4/pcDNA3．1細胞(16．07+3．58％)(P=0．005)，TUNEL法也證實NB4／VEGF-C細胞經(jīng)VP．16誘導(dǎo)的

10、細胞凋亡減少；實時熒光定量PCR檢測bcl-2基因表達約為NB4/pcDNA3．1細胞的2．28倍。 因而，VEGF-C／VEGFR-3信號途徑以自分泌形式促進白血病細胞增殖，抑制ATRA的NB4細胞分化及上調(diào)bcl-2基因來抑制化療藥介導(dǎo)的凋亡，推測VEGF-CNEGFR-3信號途徑在白血病疾病進展中發(fā)揮重要作用并可望作為白血病治療的靶點。 4.轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA促進裸鼠體內(nèi)NB4細胞種植瘤生長及血管新生。

11、 體外實驗證實自身分泌的重組VEGF-C影響VEGFR-3+的NB4細胞生物學(xué)性狀，但由于體外實驗條件是人為控制，結(jié)果難免受到非客觀因素影響，另外腫瘤細胞可能受到基質(zhì)相互關(guān)系的影響，因此裸鼠體內(nèi)NB4／VEGF-C細胞種植瘤模型的實驗研究十分必要。 每組9只4～5周齡的BALB／c裸鼠，經(jīng)4Gy6~Co照射后腋窩皮下分別接種1×10’個NB4／VEGF-C、NB4/pcDNA3．1細胞，觀察成瘤性，3周后處死裸鼠。所有細胞在裸

12、鼠腋下均成瘤，NB4／VEGF-C細胞組腫瘤生長速度快于NB4／pcDNA3．1組，NB4／VEGF-C細胞瘤體體積631．44+114．42mm3；而對照組為491．22+70．05rlli．n3，腫瘤體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．006)。NB4／VEGF-C細胞癯塊重量為321．78+27．84mg；而對照組為288．57+40．12mg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．031)。免疫組化檢測NB4NEGF-C細胞組種植瘤組織切片顯示微

13、血管密度及BCL-2蛋白表達水平高于對照組，提示VEGF-C具有誘發(fā)NB4細胞種植瘤體的血管新生，同時促進NB4細胞增殖、上調(diào)抗凋亡蛋白BC。 5．VEGF-C及其受體在慢性粒細胞白血病患者中的表達差異及臨床意義。 多種血液惡性疾病骨髓的血管密度增加并且與治療疾病進程及預(yù)后相關(guān)。近來在幾種白血病細胞株中已發(fā)現(xiàn)VEGF-C受體基因的表達，血管新生相關(guān)因子在骨髓血管分布生成和血液疾病疾病過程中的作用越來越受到關(guān)注。

14、為此收集30例CML患者(21例慢性期，6例加速期，3例急變期)及正常成人的骨髓，分離單個核細胞，抽提RNA后進行RT-PCR得到cDNA，PCR擴增VEGF-C、VEGFR-2和3基因。5例缺鐵性貧血患者及12例正常成人作為對照組。結(jié)果顯示在對照組骨髓單個核細胞中皆不表達這3種基因；在30例CML患者中，10例表達VEGF-CmRNA，4例表達VEGFR-2mRNA，9例表達VEGFR-3mRNA，其中3例同時表達VEGF-C和VEG

15、FR-2，另3例同時表達VEGF-C和VEGFR-3，1例三種基因均表達。6例CML加速期患者有4例表達VEGFR-3，1例表達VEGFR-2。3例CML急變期患者有2例同時表達VEGFR-3和VEGF-C，1例同時表達VEGFR-2和VEGF-C。VEGF-C和VEGFR-3與CML臨床分期有統(tǒng)計學(xué)差異(尸值分別=0．004,0．009)，而VEGFR-2無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．265)。結(jié)果提示VEGF-C／VEGFR-3可能以旁分泌