激活LXR通過減少膜膽固醇含量下調(diào)β-分泌酶活性.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型病理特征為老年斑的沉積和神經(jīng)原纖維的纏結(jié)。老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(beta-amyloid，Aβ)，由淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)在兩種蛋白酶即β-分泌酶和γ-分泌酶的先后裂解作用下產(chǎn)生。β-分泌酶也稱為BACE1(Beta-siteamyloidprecursorproteincleavin

2、genzyme1)，在Aβ的生成中起了至關(guān)重要的作用，是Aβ產(chǎn)生過程中的限速酶。很多研究證明膽固醇異常和AD存在著密切的聯(lián)系。臨床研究顯示高膽固醇血癥病人患AD的幾率也明顯增加。研究報道AD病人的腦中存在膽固醇代謝異常。動物實驗表明，長期給予家兔高膽固醇飲食會促進老年斑的生成，相反，用降膽固醇藥物能明顯降低Aβ的水平。肝X受體(LiverXreceptor，LXR)是配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多個與膽固醇代謝有關(guān)的基因如ATP-結(jié)合

3、盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-bindingcassettetransporterA1，ABCA1)和載脂蛋白E(ApolipoproteinE，ApoE)的表達，在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。LXR分為LXRa和LXRβ兩種亞型。LXR分布廣泛，在肝臟、脂肪組織和巨噬細胞分布較多，在腦內(nèi)也有表達。LXR的配體包括天然的氧化甾醇(oxysterol)如：24(S)-羥基膽甾醇和27-羥基膽甾醇，以及人工合成的T0901317、GW3965。人

4、工合成的LXR激活劑可以減少Aβ的生成，但機制不明。
　　那么，如果用人工合成的LXR激活劑T0901317處理APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠后，腦內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)是否發(fā)生改變?參與APP代謝的分泌酶的活性是否受到影響?激活LXR引起Aβ生成減少的原因是什么?針對這這些問題，本課題集中研究激活LXR對APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠及對原代培養(yǎng)神經(jīng)元膽固醇穩(wěn)態(tài)和β-分泌酶活性與Aβ生成的關(guān)系，以探討AD發(fā)病的相關(guān)分子機制，為臨床AD的預防和

5、治療提供新的實驗依據(jù)。主要進行了以下兩方面的工作：
　　1、激活LXR對AD模型小鼠腦內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)和β-分泌酶活性的影響。運用real-timePCR技術(shù)和Westernblot檢測LXR激活劑T0901317對LXR下游基因和蛋白的表達，結(jié)果顯示，T0901317上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)ABCA1和ApoE的表達。在T0901317處理組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠額葉皮層和海馬腦區(qū)總膽固醇含量沒有發(fā)生明顯改變，而膜膽固醇含

6、量顯著低于對照組。與對照組相比，T0901317處理組的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的面積百分比減少，差異有統(tǒng)計學意義；ELISA方法檢測Aβ的水平，與對照組相比，T0901317處理組顯著減少了小鼠腦組織中Aβ40和Aβ42的含量。通過Westernblot方法檢測BACE1蛋白表達水平，結(jié)果可見，T0901317處理組BACE1蛋白水平減低，提示激活LXR能減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)BACE1蛋白表達水平，能改善APP/

7、PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學習記憶能力。上述結(jié)果表明在APP/PS1轉(zhuǎn)基因動物，激活LXR具有降低BACE1蛋白表達、β-分泌酶活性和減少老年斑生成的作用。
　　2、激活LXP下調(diào)β-分泌酶活性的機理研究。為揭示激活LXR降低β-分泌酶活性和減少老年斑生成的原因，應(yīng)用real-timePCR、Westernblot及免疫熒光染色技術(shù)深入研究從APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬提取的原代培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)T0901317處理后ABCA1的表達變化、膜膽固

8、醇含量的變化及對β-分泌酶活性的影響。我們發(fā)現(xiàn)，加入外源的膽固醇可以增加APP/PS1原代培養(yǎng)神經(jīng)元膜膽固醇的含量，上調(diào)β-分泌酶的活性。用甲基-β-環(huán)糊精抽提膽固醇后發(fā)現(xiàn)，APP/PS1原代培養(yǎng)神經(jīng)元膜膽固醇含量減少，并伴隨著β-分泌酶活性降低和Aβ生成減少。提示膜膽固醇的含量能影響到β-分泌酶的活性。T0901317處理細胞后，ABCA1mRNA表達顯著高于對照組，膜膽固醇含量和β-分泌酶活性降低。為了進一步證明.ABCA1在T09

9、01317誘導的膜膽固醇水平降低過程中所起的作用，用ABCA1的抑制劑glyburide處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元，結(jié)果表明glyburide能夠逆轉(zhuǎn)T0901317的降低膜膽固醇含量和降低β-分泌酶活性的作用，提示T0901317下調(diào)β-分泌酶活性的能力需要ABCA1的參與。為了驗證LXR在T0901317上調(diào)ABCA1表達和下調(diào)β-分泌酶活性過程中是否起作用，用LXR的拮抗劑GGPP(geranylgeranylpyrophosphate，

10、GGPP)和T0901317共處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)用LXR拮抗劑后，T0901317上調(diào)ABCA1表達、降低膜膽固醇和降低β-分泌酶活性這些作用幾乎消失，說明用LXR拮抗劑阻斷LXR能逆轉(zhuǎn)T0901317對原代培養(yǎng)神經(jīng)元ABCA1、膜膽固醇含量和β-分泌酶的作用。
　　綜上所述，我們的實驗提示：激活LXR可改變APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)，減少BACE1蛋白的表達，降低β-分泌酶活性和老年斑的生成。激活LXR是通過