膽固醇及辛伐他汀規(guī)律前列腺癌Hedgehog激活機制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate Cancer，PCa)是威脅男性健康的常見腫瘤之一。在美國，前列腺癌自1984年以來就是男性最常見的內(nèi)臟惡性腫瘤。僅2005年就有232，090例新發(fā)病例，占所有男性腫瘤的1/3，2005年前列腺癌相關(guān)死亡30，350例，死亡率居所有腫瘤第二位。我國前列腺癌發(fā)病率也逐年升高，目前已位居男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第三位。雄激素阻斷治療是前列腺癌的治療中不可替代的一種治療方法，包括藥物或外科手術(shù)阻斷雄激素療法(ADT)

2、，用于外科手術(shù)及放療后的輔助治療以及轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療，然而，這些治療方法卻伴隨著許多副作用，例如脂質(zhì)代謝紊亂和心血管疾病。ADT通常只能使腫瘤暫時緩解，最終將進展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)。
　　 近年來研究表明，高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進展密切相關(guān)。高血清膽固醇水平能夠促進前列腺癌的發(fā)展并且刺激雄激素上調(diào)表達，通過改變飲食及藥物降低血清膽固醇水平將有助于減緩前列腺癌的進展。一系列的病理和臨床

3、前觀察已經(jīng)證實，通過改變飲食及藥物降低膽固醇水平有助于減緩前列腺癌的進展。盡管其具體作用機制尚未闡明，但是數(shù)據(jù)清楚表明這不是通過雄激素介導(dǎo)的機制。許多研究表明，普通前列腺增生和前列腺中都聚集了不同尋常的高水平膽固醇。目前尚不清楚為什么高膽固醇可變信號分子和導(dǎo)致腫瘤細胞增生，有證據(jù)表明腫瘤細胞細胞膜上的膽固醇積聚直接改變，甚至導(dǎo)致異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為什么改變細胞膜膽固醇水平影響腫瘤細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?
　　 我們的體外實驗研究證實在低膽

4、固醇水平條件下前列腺癌細胞LNCAP-AD，LNCAP-AI及PC-3增殖均受到抑制，分泌至細胞外的Hedgehog蛋白下調(diào)，而細胞內(nèi)的Hedgehog蛋白表達上調(diào)。Hedgehog基因是一種分節(jié)極性基因，因突變的果蠅胚胎呈多毛團狀，酷似受驚刺猬而得名。哺乳動物中存在三個Hedgehog的同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Desert Hedgehog(DHH)，分別編碼Shh、

5、Ihh和Dhh蛋白。Hedgehog在細胞分化、胚胎發(fā)育、器官形成、損傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生中都有重要生理和病理意義。膽固醇促進前列腺癌細胞增殖的具體分子機制目前尚未完全闡明。膽固醇是否是Hedgehog信號通路的重要影響因子，以及在低膽固醇條件下是否是通過Hedgehog下調(diào)作用抑制前列腺癌細胞增殖目前尚無相關(guān)報道。
　　 本研究通過MTT(CCK-8)實驗檢測分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基(NM)、膽固醇耗竭培養(yǎng)液(CDM)，高膽固醇培養(yǎng)基

6、(HCM)以及加入辛伐他汀后各組中的前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞的增殖情況，進一步采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、Real-time PCR檢測Hedgehog的mRNA水平變化，同時檢測Hedgehog下游信號通路蛋白Ptc，Smo和Gli的mRNA表達變化；ELISA方法檢測分泌至胞外的Hedgehog蛋白水平變化；并進一步采用激光共聚焦方法檢測Hedgehog蛋白的亞細胞定位情況；確

7、定在低膽固醇和降血脂(辛伐他汀)條件下，是否是抑制Hedgehog信號通路激活從而抑制細胞增殖，從而論證在前列腺癌細胞中膽固醇是Hedgehog信號通路的重要影響因子。初步揭示高膽固醇條件下通過上調(diào)Hedgehog胞外分泌表達而促進前列腺癌發(fā)展的分子機制，為治療前列腺癌提供新的思路。
　　 一、膽固醇規(guī)律前列腺癌細胞中Hedgehog的表達及意義
　　 目的：
　　 研究比較分別培養(yǎng)于NM、CDM、HCM各組中人

8、前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞的增殖凋亡情況以及Hedgehog信號通路的表達差異，分析膽固醇對Hedgehog信號通路的影響與前列腺癌進展的關(guān)系。
　　 方法：
　　 以人前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞系為研究對象，分別培養(yǎng)于NM、CDM和HCM中。MTT方法檢測細胞增殖凋亡情況，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、Real-time PCR、EL

9、ISA方法檢測Hedgehog的mRNA和蛋白水平變化；同時檢測Hedgehog下游信號通路蛋白Ptc，Smo和Gli1的mRNA表達變化；并以激光共聚焦觀察不同膽固醇濃度條件下Hedgehog在細胞內(nèi)定位情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、培養(yǎng)于CDM的前列腺癌細胞增殖曲線明顯低于培養(yǎng)于NM和HCM的細胞。
　　 2、培養(yǎng)于CDM的前列腺癌細胞分泌Hedgehog的蛋白水平明顯低于培養(yǎng)于NM和HCM的細胞表達，兩者

10、有顯著差異。
　　 3、培養(yǎng)于CDM的前列腺癌細胞Hedgehog，Smo和Gli表達增加，而Ptc表達下降。
　　 4、激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)CDM組前列腺癌細胞的Hedgehog蛋白在細胞內(nèi)表達明顯高于NM和HCM組。
　　 結(jié)論：
　　 1、低膽固醇抑制前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞體外增殖。
　　 2、低膽固醇抑制前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP

11、-AI細胞中的Hedgehog蛋白胞外分泌過程。
　　 3、低膽固醇抑制前列腺癌細胞增殖與Hedgehog的胞外分泌下調(diào)有關(guān)。
　　 二、辛伐他汀規(guī)律前列腺癌細胞中Hedgehog的表達及意義
　　 目的：
　　 研究比較分別培養(yǎng)于不同濃度辛伐他汀的NM、HCM各組中人前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞的增殖凋亡情況以及Hedgehog信號通路的表達差異，分析辛伐他汀對Hedge

12、hog信號通路的影響與前列腺癌進展的關(guān)系。
　　 方法：
　　 以人前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞系為研究對象，分別培養(yǎng)于NM和HCM中，各組中分加不同濃度辛伐他汀。MTT方法檢測細胞增殖凋亡情況，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、Real-time PCR、ELISA方法檢測Hedgehog的mRNA和蛋白水平變化；同時檢測Hedgehog下游信號通路蛋白Ptc，Smo和Gl

13、i的mRNA表達變化；并以激光共聚焦觀察不同辛伐他汀濃度條件下Hedgehog在細胞內(nèi)定位情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、培養(yǎng)于2.4μM辛伐他汀的NM和HCM前列腺癌細胞增殖曲線明顯低于培養(yǎng)于未加辛伐他汀的NM和HCM培養(yǎng)基的細胞，呈濃度依賴關(guān)系。
　　 2、培養(yǎng)于2.4μM辛伐他汀的NM和HCM中的前列腺癌細胞上清液中Hedgehog的蛋白水平明顯低于未加辛伐他汀的NM和HCM的細胞，兩者有顯著差異。

14、　　 3、培養(yǎng)于2.4μM辛伐他汀的NM和HCM中的前列腺癌細胞Hedgehog，Smo和Gli表達增加，而Ptc表達下降。
　　 4、激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)2.4μM辛伐他汀的NM和HCM組前列腺癌細胞的Hedgehog蛋白在細胞內(nèi)表達明顯高于未加辛伐他汀的NM和HCM組。
　　 結(jié)論：
　　 1、高濃度辛伐他汀抑制前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞以及LNCaP-AI細胞體外增殖。
　　 2、高濃度辛