2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:肌萎縮側(cè)索硬化[Amyotrophiclateralsclerosis,(ALS)],是一個致死性的神經(jīng)變性疾病,臨床表現(xiàn)為肌萎縮,肌強(qiáng)直,無力等。通常在診斷后的3-5年就可以死亡。最近,在ALS和伴有泛素陽性包涵體的額顳葉癡呆病人[frontotemporallobardementiawithubiquitin-positiveinclusions,(FTLD-U)]的腦中發(fā)現(xiàn)了泛素化的包涵體,其中TDP-43是主要的組成成分。

2、所以,TDP-43在神經(jīng)變性疾病中受到越來越多的人的關(guān)注。TDP-43,它是普遍存在的核蛋白,由414個氨基酸組成。它是由1號染色體上的TARDBP基因編碼的。它的作用包括了特異性前RNA的剪切和轉(zhuǎn)錄,信使RNA的穩(wěn)定性以及小RNA的生物發(fā)生等。至今,已在散發(fā)和遺傳性的ALS病人的TDP-43基因中發(fā)現(xiàn)40多種的顯性突變,就為TDP-43功能異常和變性疾病中提供了直接的證據(jù)。TDP-43的發(fā)現(xiàn)為我們研究ALS和FTLD-U的發(fā)病機(jī)制開拓

3、了新的視野。在ALS的發(fā)病機(jī)制中,線粒體是多個發(fā)病機(jī)制的匯合點(diǎn)。大量的研究表明在突變的SOD1相關(guān)的ALS的病人,細(xì)胞以及動物模型中,線粒體損傷參與了發(fā)病機(jī)制過程。其中突變和野生型的SOD1在線粒體上聚集是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。相對應(yīng)的是在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中,同樣存在線粒體膜電位的降低,ROS的生成增多以及呼吸鏈的受損等線粒體損傷的證據(jù)。線粒體選擇性的自噬在線粒體的質(zhì)量控制機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,它參與了帕金森病、阿爾茨海默病的發(fā)病

4、機(jī)制。但是在ALS的模型中,研究的卻非常少。
   大蒜素,它是大蒜油中有機(jī)硫化合物的主要成分,由于其強(qiáng)大的抗癌效應(yīng)受到越來越多的關(guān)注。在動物模型中,它不但可以通過多種機(jī)制保護(hù)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌癥,抗癌機(jī)制包括調(diào)控致癌物的代謝,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來阻止腫瘤細(xì)胞的增長,誘導(dǎo)凋亡,組氨酸的修飾,抑制血管的再生。大蒜素其他的健康益處包括抗血栓效應(yīng),改善免疫功能,降低血糖,防止輻射和微生物的侵入。另外,其神經(jīng)保護(hù)作用在ALS的脊髓培養(yǎng)模型

5、和SOD1的轉(zhuǎn)基因鼠中均得到驗(yàn)證,但是在ALS的細(xì)胞模型中的療效卻沒有證實(shí)。
   第一部分過表達(dá)TDP-43及其片段對線粒體的功能和形態(tài)的影響
   目的:本研究的目的是探討TDP-43及其片段對線粒體的功能和形態(tài)的影響。
   方法:在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP-35的質(zhì)粒。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,收集細(xì)胞并用western印跡驗(yàn)證細(xì)胞的表達(dá)效率;

6、用免疫熒光觀察外源性蛋白的分布特點(diǎn);用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察TDP-43及其片段對線粒體膜電位和活性氧簇的影響;用免疫熒光觀察外源性蛋白對線粒體形態(tài)的影響。
   結(jié)果:(1)在NSC34細(xì)胞中可以順利表達(dá)外源性的TDP-43蛋白。并且表達(dá)全長的TDP-43蛋白水平和內(nèi)源性TDP-43蛋白水平差不多,表達(dá)片段的TDP-43水平大約是內(nèi)源性TDP-43蛋白水平的一半。
   (2)在對照細(xì)胞中,內(nèi)源性的TDP-43主要在胞核中。

7、在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,全長的TDP-43蛋白主要分布在胞核中,一部分在胞漿中存在。而片段化的TDP-43更容易形成在胞核和胞漿致密的包涵體。
   (3)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,表達(dá)全長及片段的TDP-43細(xì)胞和空質(zhì)粒對照的細(xì)胞相比,線粒體的膜電位降低了,活性氧簇的水平明顯上升。
   (4)通過激光共聚焦顯微鏡觀察,轉(zhuǎn)染全長及片段的TDP-43的細(xì)胞中,線粒體的分布不均勻和聚集更多見。
   結(jié)論:表達(dá)全長及片段

8、TDP-43的NSC34細(xì)胞和對照細(xì)胞相比,明顯降低了線粒體膜電位的水平,提高了活性氧簇的水平,并且干擾了線粒體的正常分布。
   第二部分過表達(dá)TDP-43及其片段對線粒體自噬的影響
   目的:本研究的目的是探討TDP-43及其片段對線粒體自噬的影響。
   方法:在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP-35的質(zhì)粒。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,用勻漿器離心方法提

9、取胞漿和線粒體組分,然后用透射電鏡和Western印跡檢測提取線粒體的純度和形態(tài);并用Western印跡技術(shù)檢測各組分外源性和內(nèi)源性TDP-43的表達(dá),用免疫熒光觀察外源性TDP-43和線粒體的分布關(guān)系,用western印跡技術(shù)檢測線粒體和胞漿中LC3B、P62的蛋白水平。
   結(jié)果:(1)用透射電鏡技術(shù)檢測提取的線粒體形態(tài)保存尚好,純度約在90%以上。用western印跡檢測線粒體部分的標(biāo)記物VDAC1和胞漿部分的標(biāo)記物ac

10、tin,彼此并不摻雜,說明提取線粒體的純度高。
   (2)用western印跡檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中胞漿和線粒體部分的外源性TDP-43,在線粒體上可有少量的外源性TDP-43的存在,而且野生型和突變型的水平差不多。用免疫熒光檢測結(jié)果表明,外源性TDP-43可以和線粒體的標(biāo)記物共定位。
   (3)用western印跡分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中胞漿和線粒體部分的外源性TDP-43、內(nèi)源性TDP-43、LC3B、P62的蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染全

11、長TDP-43細(xì)胞比空質(zhì)粒對照細(xì)胞中,線粒體部分的內(nèi)源性TDP-43的表達(dá)明顯升高,LC3B蛋白水平明顯升高,P62的蛋白水平顯著降低。在轉(zhuǎn)染片段的TDP-43的細(xì)胞中,線粒體外膜蛋白VDAC1的水平降低,而線粒體部分的LC3B蛋白水平明顯升高,P62的蛋白水平顯著降低。
   結(jié)論:勻漿離心法提取的線粒體形態(tài)完整,純度高;外源性TDP-43在線粒體部分少量存在;轉(zhuǎn)染外源性TDP-43的細(xì)胞,LC3B蛋白水平明顯升高,P62的蛋

12、白水平顯著降低,激活了線粒體自噬。
   第三部分大蒜素在肌萎縮側(cè)索硬化模型中神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的探討
   目的:本研究的目的是探討大蒜素在肌萎縮側(cè)索硬化模型中的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。
   方法:用CCK-8法檢測不同濃度和時間的大蒜素處理的NSC34細(xì)胞后,對細(xì)胞活力影響;采用合適的濃度及時間的大蒜素干預(yù)NSC34細(xì)胞后,用western印跡技術(shù)檢測LC3B蛋白水平;在轉(zhuǎn)染攜帶GFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞中,在不同

13、濃度的大蒜素處理后,用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點(diǎn)狀聚集的情況;在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中,選擇合適濃度的大蒜素干預(yù)后,用western印跡技術(shù)檢測外源性TDP-43變化;分別選用自噬通路阻斷劑(BafilomycinA1)和蛋白酶體通路阻斷劑(MG132)處理細(xì)胞,觀察大蒜素是通過什么途徑影響蛋白水平;在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中,選擇合適濃度的大蒜素干預(yù)后,用Western印跡技術(shù)檢測胞核部分Nrf2的表達(dá)情況與細(xì)胞中抗氧化酶的表

14、達(dá)水平。
   結(jié)果:(1)分別用不同濃度(0-100μM)的大蒜素處理NSC34細(xì)胞24h后,在0-10μM的大蒜素對于細(xì)胞活力沒有明顯區(qū)別,在20-100μM之間的大蒜素依據(jù)藥物濃度逐漸增大,細(xì)胞毒性逐漸增加。在10μM的大蒜素處理下,處理48h后,細(xì)胞活力明顯下降。
   (2)分別用不同濃度(0-10μM)的大蒜素處理NSC34細(xì)胞24h后,用western印跡檢測結(jié)果表明,LC3-Ⅱ的水平是逐漸升高;分別用10

15、μM的大蒜素處理NSC34細(xì)胞不同時間(0-36h)后,Western印跡檢測結(jié)果表明,處理24h后,LC3-Ⅱ的水平是最高的;用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點(diǎn)狀聚集,結(jié)果表明在處理24h后,攜帶點(diǎn)狀聚集的細(xì)胞數(shù)目是依濃度增加而逐漸最多的。
   (3)在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP35的質(zhì)粒,給予10μM的大蒜素處理24h后,Western印跡檢測結(jié)果表明,外源

16、性TDP-43水平都有顯著的下降;給予自噬通路阻斷劑(BafilomycinA1)和蛋白酶體通路阻斷劑(MG132)阻斷處理后,western印跡檢測結(jié)果表明,大蒜素在BafilomycinA1存在的情況下,不能降解TDP-25蛋白水平,而在MG132存在的情況下,仍然可以降解。結(jié)果表明大蒜素是通過自噬途徑來促進(jìn)蛋白的降解。
   (4)在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TD

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