LOXL3和HKR3對腫瘤細(xì)胞株端粒酶活性的影響.pdf

1、端粒是由許多簡單重復(fù)序列及相關(guān)蛋白組成的染色體末端復(fù)合結(jié)構(gòu),端粒酶是具有逆轉(zhuǎn)錄酶特性的核糖核蛋白復(fù)合物,能以自身的RNA為模板合成端粒重復(fù)序列,加至新合成的DNA鏈末端,維持端粒平衡從而保證染色體末端結(jié)構(gòu)完整性及解決末端復(fù)制問題.端粒與腫瘤、衰老等生理或病理狀態(tài)都有密切關(guān)系,端粒酶蛋白結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)制是當(dāng)今研究的重要方向.人端粒酶至少由三個亞單位組成,即端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)1(TP1)和端粒酶蛋白催化亞單位(hTER

2、T/hTRT/hEST2),其中hTERT被認(rèn)為是端粒酶的主要逆轉(zhuǎn)錄酶部分.為了發(fā)現(xiàn)新的端粒酶蛋白亞單位或調(diào)控hTERT的端粒相關(guān)分子,通過構(gòu)建pGBKT7-hTRT誘餌融合蛋白表達(dá)載體,應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù),從人睪丸cDNA文庫中篩選出六種與hTERT作用的端粒相關(guān)未知蛋白,它們的編碼基因?yàn)長OXL3、HKR3、T-STAR、SMARCB1、par-4和NISCH.該研究通過構(gòu)建LOXL3和HKR3的正、反義真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染不同的

3、腫瘤細(xì)胞株,觀察LOXL3和HKR3對端粒酶活性的影響,進(jìn)一步了解LOXL3和HKR3與端粒酶的關(guān)系.方法:1、從ATCC購買LOXL3和HKR3的cDNA克隆;2、構(gòu)建正、反義LOXL3和HKR3真核表達(dá)載體;3、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株SGC-7901、HepG2和SHG44,并確定它們的最小殺死濃度;4、應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將正、反義LOXL3和HKR3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染以上三種腫瘤細(xì)胞,并在最低抑制濃度的G418選擇壓力下篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;5

4、、用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的neo基因表達(dá),證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的正確性;6、運(yùn)用RT-PCR半定量法測定腫瘤細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組和正、反義轉(zhuǎn)染組的LOXL3和HKR3表達(dá)量;7、運(yùn)用TRAP-ELISA法測定腫瘤細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組和正、反義轉(zhuǎn)染組的的端粒酶活性;8、使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理結(jié)果.結(jié)果:1、酶切鑒定證實(shí)LOXL3正義表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-LOXL3-S、LOXL3反義表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-LOXL3-A

5、S、HKR3反義表達(dá)載體pCL-neo-HKR3–AS構(gòu)建成功;2、SGC-7901 、HepG2和SHG44細(xì)胞的MIC濃度分別為400、700、200ug/ml;3、轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞RT-PCR法顯示均有neo基因表達(dá),說明轉(zhuǎn)染成功;4、三株細(xì)胞均有LOXL3和HKR3表達(dá),與未轉(zhuǎn)染組相比,正、反義轉(zhuǎn)染組的LOXL3和HKR3表達(dá)量均有顯著性差異(P<0.05);5、與未轉(zhuǎn)染組相比,SGC-7901、HepG2 、SHG44細(xì)胞在L

6、OXL3正義基因轉(zhuǎn)染后端粒酶活性分別降低5.4﹪、9.3﹪和升高7.5﹪,反義LOXL3基因轉(zhuǎn)染三種細(xì)胞后端粒酶活性分別升高7.3﹪、8.5﹪和降低7.7﹪,與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均無顯著性差異,從此結(jié)果看,LOXL3對端粒酶活性無明確影響;6、正義HKR3基因轉(zhuǎn)染SGC-7901、HepG2 、SHG44細(xì)胞后端粒酶活性分別降低20.9﹪、27.4﹪和29.4﹪,反義HKR3基因轉(zhuǎn)染SGC-7901、HepG2 、SHG44細(xì)胞后端粒酶活性分

7、別升高11.9﹪、9.6﹪和15.8﹪,與未轉(zhuǎn)染組均有顯著性差異;7、對正、反義HKR3轉(zhuǎn)染SGC-7901、HepG2 、SHG44前后的HKR3 mRNA和端粒酶活性之間進(jìn)行相關(guān)性分析,顯示有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)(r=-0.783,P=0.013),即HKR3表達(dá)升高時端粒酶活性降低,而HKR3表達(dá)抑制時端粒酶活性升高.但相關(guān)性分析僅僅說明HKR3會影響端粒酶活性.結(jié)論:1、成功構(gòu)建了LOXL3正、反義真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-L