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文檔簡介
1、目的:
類風濕關節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是以滑膜炎癥和關節(jié)軟骨及骨破壞為特征的全身性慢性自身免疫病,以炎性細胞在關節(jié)滑膜處浸潤,滑膜增生,血管翳形成,關節(jié)軟骨及骨的持續(xù)破壞為特征,研究表明T細胞尤其是輔助性T細胞(Thelpercell,Th)在RA的發(fā)病及進展中可能發(fā)揮著重要作用。在過去的幾十年里,RA被認為是由Th1細胞介導的自身免疫病。Th1的細胞表型與炎癥有關,而與之相對的Th2細胞在某種程
2、度上可以抗炎癥。Th1/Th2失衡可產生過量的(腫瘤壞死因子)TNF-α,TNF-α誘發(fā)的級聯反應導致炎癥的遷延以及關節(jié)軟骨和骨的破壞。
近年來,兩群新的Th細胞亞群——Th17和調節(jié)性T細胞的發(fā)現,打破了以往僅以Th1/Th2失衡模式解釋RA的發(fā)病及進展,深入探討Th亞群細胞及其相互關系將有助于運用促炎/抗炎細胞平衡概念全新的了解包括RA在內的自身免疫病的發(fā)病機制,并為這些自身免疫病的治療開拓了新的領域。
近10年
3、余來靶向免疫炎性細胞或分子的生物制劑的應用,開啟了RA治療新紀元。依那西普(etanercept)、英夫利西單抗(infliximab)及阿達木單抗等抗TNF-α藥物已廣泛應用于臨床,對多數中、重度活動性RA具有明顯改善病情和改善預后的效果。但令人關注的是,尚有一部分患者不能達到理想的治療效果。
鑒于Th細胞亞群失衡及其相關細胞因子網絡和“瀑布效應”的異常是RA發(fā)病及病情進展的重要機制,作為T細胞分化和應答上游和下游調控的TN
4、F-α的消長必然在此機制中發(fā)揮重要作用。那么RA患者Th細胞亞群失衡的嚴重程度是否會影響TNF-α拮抗劑的治療效果,使用TNF-α拮抗劑治療后其體內Th細胞亞群及細胞因子是否能夠重新分布從而達到失衡逆轉及免疫穩(wěn)態(tài)的維持,這一改變與疾病的轉歸和預后是否存在聯系,如果存在聯系,是否可以通過對患者免疫狀態(tài)的評估來預測患者的治療反應和預后,對RA患者Th細胞亞群的深入研究是否能發(fā)現新的治療靶點,這些都是需要密切關注的問題。
因此,本研
5、究旨在建立穩(wěn)定的Th亞群細胞檢測技術的基礎上:1.進一步證明RA發(fā)病過程中體內存在的Th細胞亞群及其相關細胞因子之間失衡狀態(tài)并觀察患者在接受抗TNF-α藥物治療后體內失衡狀態(tài)的改善及與疾病緩解程度的相關性;2.研究疾病不同病程階段及不同活動度時體內Th細胞亞群及其相關因子的分布狀況,尤其研究Th17細胞在不同病期和不同疾病活動度時炎癥表型和趨化因子表達的情況;3.研究對抗TNF-α治療效果不同的患者其體內治療前后體內T細胞亞群分布及炎癥
6、表型的表達情況,探討抗TNF-α治療效果不佳或復發(fā)的可能機制,為臨床用藥提供參考。
方法:(分三部分)
1.依那西普對RA患者外周血Th1/Th2,Th17/Treg及相關因子的影響
選取門診或住院治療的診斷明確的活動期RA患者20例,隨機分為2個研究組:聯合治療組,每組10例,給予MTX7.5~15mg口服,每周一次,同時給予皮下注射ETA每次25mg,每周2次;MTX單藥治療組,單用MTX7.5~15m
7、g治療,口服,每周一次。兩組療程均為12周。另外選取10名年齡、性別與研究病例匹配的健康體檢者作為健康對照;用疾病活動度評分(DAS28)評估患者治療前后病情活動情況;采用流式細胞術檢測患者外周血中Th1、Th2、Th17和調節(jié)性T細胞(Treg)占CD4+T細胞的百分比,比較治療前后Th1/Th2、Th17/Treg平衡在治療前后的變化及其與疾病改善程度的相關性;用ELISA檢測患者外周血血清中炎性細胞因子IL-1β、IFN-γ、TN
8、F-α、IL-6、IL-17,、IL-23及抗炎細胞因子TGF-β、IL-4、IL-10的表達在治療前后的消長及其與Th細胞平衡變化的相關性。
2.對不同病期及不同活動程度RA患者外周血中Th細胞亞群表型和轉錄因子的研究
選取門診或住院治療的診斷明確的早期RA(病程<1年)患者41例,既往RA(病程≥1年)患者50例,上述患者根據疾病活動程度又分為低活動度(DAS28≤2.6)和中到重度活動度(DAS28≥3.2)兩
9、組;運用流式細胞術胞內及胞外染色方法檢測所有RA患者胞內因子IFN-γ、IL-17、RORc、Foxp3的表達及Th17細胞上CCR6、CCR4、IL-23R的表達;使用real-timeRT-PCR法測定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表達量。
3.研究TNF-α拮抗劑治療對RA患者外周血中Th細胞亞群表型和轉錄因子的影響
對2008年12月至2009年12月期間門診或住院的診斷明確的接受TNF-
10、α拮抗劑治療的所有同意簽署知情同意書的RA患者進行為期12個月的隨訪和觀察,從中選取了15例治療12個月(不伴隨其他DMARDs)后達到ACR50緩解標準的患者,選取10例治療后(不伴隨其他DMARDs)未達到ACR20緩解標準的患者進行數據統(tǒng)計研究。所選的兩組患者在年齡、性別、病程上沒有顯著差異,且所有患者在使用TNF-α拮抗劑治療前疾病嚴重活動(DAS28>5.1)。所有患者每個月隨訪一次,進行病情評估和相關實驗室檢測;利用流式細胞
11、術檢測患者治療前后外周血中Th1、Th2、Th17和Treg占CD4+T細胞的百分比,檢測胞內因子IFN-γ、IL-4、IL-17、RORc的表達及Th17細胞上CCR6,CCR4,IL-23R的表達;使用real-timeRT-PCR法測定外周血中T-bet、RORc及Foxp3mRNA的表達情況。
結果:
1.開始治療前,兩組患者外周血中的Th1細胞和Th17細胞占CD4+T細胞比例均顯著比正常人高(分別p<0.
12、05,p<0.001),但Treg細胞的百分比顯著低于正常人(p<0.005),而Th2細胞在三組之間沒有顯著差異。經12周治療后,ETA+MTX聯合治療的患者Th1和Th17占CD4+T細胞百分比顯著下降(分別p<0.05,p=0.007),Treg細胞百分比顯著升高(p=0.033),而對單獨MTX治療的患者,各個細胞均無明顯差異。Th2細胞在兩組患者中均沒有明顯變化。
所有RA患者治療12周后,其Th17與Treg的比值
13、都顯著下調,提示RA患者體內Th17與Treg之間的平衡有所逆轉,而Th1和Th2之間的失衡卻沒有明顯變化。
將治療前后DAS28的變化(ΔDAS28)作為疾病改善程度的指標,采用Spearman相關性分析,發(fā)現使用MTX單獨治療的患者,其疾病改善程度(ΔDAS28)與Th1/Th2平衡和Th17/Treg平衡的逆轉都沒有相關性,在MTX+ETA聯合治療的患者,雖然其疾病的改善同Th1/Th2平衡的逆轉沒有明顯的相關性,但與T
14、h17/Treg平衡的逆轉有很強的相關性。
接受ETA+MTX聯合治療的患者,其血清中前炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23的表達量均較治療前有顯著下降,而抑炎因子TGF-β的表達顯著上升。在MTX單獨治療組,并未發(fā)現這些細胞因子的表達有顯著變化。ETA+MTX聯合治療的患者,其外周血中Th17/Treg平衡同血清中IL-6的水平呈負相關關系而與TGF-β的水平呈正相關關系。
2.早期
15、患者不管病情活動與否,體內都有較高水平的IL-17+Th17細胞(p<0.05),而既往患者體內卻有較高表達水平的IFN-γ+Th1細胞(p<0.05)。早期患者體內CCR4+CCR6+T細胞和CCR4+CCR6-T細胞都較中晚期患者高(p<0.05),且CCR4和CCR6在CD4+T細胞上的雙陽性表達同體內分泌IL-17的Th17細胞百分率密切相關(r=0.972,p<0.001),而只表達CCR4可能與IFN-γ的分泌有關(r=0.
16、625,p<0.05),只表達CCR6的細胞可能既可以分泌IFN-γ,也可分泌IL-17(r=0.619,p<0.05)。
疾病活動時Th17上CCR6的表達比低活動度患者顯著升高(p<0.05),且早期活動患者Th17細胞上表達的CCR6比中晚期活動患者顯著升高(p<0.05)。CCR4在Th17細胞上的表達在各組RA患者之間沒有顯著差異。對RORc的表達,早期RA低活動度患者顯著高于中晚期低活動度患者(p<0.05),但顯
17、著低于早期疾病中重度活動的患者(p<0.05),中晚期患者疾病活動時表達顯著高于低活動度時(p<0.05)。早期RA患者疾病中重度活動時Th17細胞上表達的IL-23R顯著高于低活動度時,而對中晚期患者沒有顯著差異,不論患者疾病是否活動,IL-23R在Th17細胞上的表達在早期患者都更顯著(p<0.001)。
早期RA患者疾病中重度活動時,Foxp3占CD4+CD25highTreg的百分率顯著低于活動度低時(p<0.05),
18、并且不論疾病活動與否,中晚期患者外周血中Foxp3表達率均顯著低于早期患者(p<0.05)。
轉錄因子T-betmRNA在各組患者中分子水平的表達并沒有顯著差異。RORc及Foxp3mRNA的表達在早期患者沒有顯著差異,但在中晚期患者,疾病活動與不活動患者的表達存在差異,表現為RORcmRNA在中重度活動患者表達顯著升高(p<0.05),而Foxp3mRNA表達顯著下降(p<0.05)。
3.經TNF-α拮抗劑治療后
19、,Th1占CD4+T細胞百分比均沒有明顯減少,而Th17細胞占CD4+T細胞百分比顯著降低,且在達到ACR50反應標準的患者中降低更明顯,Treg細胞在達到ACR50反應標準的患者中顯著升高,而對于治療反應差(未達到ACR20緩解)的患者,Treg細胞并沒有顯著升高。
達到ACR50標準的患者,其外周血中IFN-γ+IL-17-T細胞及IFN-γ-IL-17+T細胞占CD4+T細胞的百分率均較治療前有明顯下降,而未達到ACR2
20、0標準的患者,其外周血中的IFN-γ+IL-17+T的百分率相比治療前有所升高且有統(tǒng)計意義,IFN-γ+IL-17-T細胞也升高但無統(tǒng)計意義。
達到ACR50標準的患者,其CCR4、CCR6及IL-23R的表達均比治療前有顯著下降,且其中CCR4+CCR6+T細胞和CCR4-CCR6+T細胞數量顯著下降,同時轉錄因子RORc的表達率也顯著下降,而對未達ACR20標準的患者,上述細胞炎癥表型的表達均無顯著變化。
達到A
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