CD147及整合素拮抗劑抑制RA患者Th17細胞分化的作用和意義.pdf

1、【背景】
　　類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)以關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為特征,是一種常見的慢性、系統(tǒng)性炎性機能紊亂的自身免疫性疾病,其病因復(fù)雜,發(fā)病機制尚不明確。Thl7細胞作為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的輔助性T細胞(Th),在RA發(fā)病中過度表達IL-17并通過上調(diào)多種促炎因子TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),于RA病程的各個階段都發(fā)揮著重要的作用。
　　因此,Th17細胞的

2、分化及調(diào)控機制成為人們研究熱點。現(xiàn)今有關(guān)Th17細胞分化的研究主要集中于多種細胞因子作用下的體外培養(yǎng),而體內(nèi)是一個相互交錯的免疫網(wǎng)絡(luò),多種細胞因子及免疫細胞均參與Th17細胞的分化與調(diào)控。RA滑膜中浸潤著大量的來自骨髓的單核細胞,這些細胞遷移至關(guān)節(jié)后活化分化為滑膜巨噬細胞。在遷移至關(guān)節(jié)滑膜的過程中,單核細胞吞噬外源性抗原。在關(guān)節(jié)中,單核細胞轉(zhuǎn)化的巨噬細胞可以將吞噬消化的抗原遞呈給記憶性T細胞,并引發(fā)T細胞的活化與分化。近期PNAS有文獻

3、報道RA患者體內(nèi)活化的單核細胞特異性誘導(dǎo)Th17細胞應(yīng)答,且不依賴TNF-及IL-1等細胞因子作用,而是以細胞接觸的方式促進Th17細胞反應(yīng)。CD147作為一種跨膜分子,可能參與T細胞免疫突觸形成與T細胞活化:CD147在TCR/CD3活化的T細胞表達上調(diào),且共定位于TCR/CD3介導(dǎo)的帽形結(jié)構(gòu)或免疫突觸中;采用CD147單克隆抗體5A12可下調(diào)IL-2及其受體CD25的表達。CD147分子有諸多配體,其中包括CyPA: X線衍射及核磁

4、共振顯示CD147與CyPA相互結(jié)合位點與肽脯氨酸異構(gòu)酶(Peptidelprolyl cistransisomersae,PPIase)活性活性位點相重疊。CyPA又為免疫抑制劑CsA作用蛋白受體,有文獻報道CsA有抑制免疫突觸形成的作用。同時,CD147是一個潛在的粘附分子,可與整合素家族3β1、6β1、4β1等形成復(fù)合物,參與細胞粘附等多種生物學作用。CD147與RA關(guān)系密切:RA患者滑膜中CD147分子和mRNA表達均顯著增高,

5、活動期RA患者的關(guān)節(jié)組織中CD147的染色范圍更為廣泛,并且同浸潤的巨噬細胞相關(guān)。為研究在RA發(fā)病機制中,Th17細胞和CD147分子可能參與的重要作用,本實驗擬建立體外CD14~+和CD4~+T細胞共培養(yǎng)體系,從而誘導(dǎo)Th17細胞;并在RA和健康人對照中,針對可能與免疫突觸相關(guān)的CD147分子和其配體(整合素與CyPA),通過阻斷實驗驗證CD147分子和整合素是否參與單核細胞誘導(dǎo)Th17細胞分化的過程。
　　實驗內(nèi)容:【目的】<

6、br>　　1.摸索活化的CD14~+細胞誘導(dǎo)CD4~+T細胞向Th17細胞分化的最佳條件,建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)Th17細胞的共培養(yǎng)體系。
　　2.驗證活化的單核細胞同CD4~+T細胞直接接觸作用對Th17細胞分化的促進作用。
　　3.觀察比較RA患者與健康人的外周血CD4~+T細胞和CD14~+單核細胞共培養(yǎng)體系中Th17細胞比例,分泌的IL-17含量及其相關(guān)細胞因子的表達。
　　4.探討CD147抗體、 CsA和整合素拮抗

7、劑cRGD對RA患者CD4~+T細胞和CD14~+單核細胞共培養(yǎng)體系中Th17細胞生成、表面分子表達及分化相關(guān)細胞因子IL-1β和IL-6分泌的影響。
　　【方法】
　　1.采用免疫磁珠法分離純化健康人外周血CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞,分別在單加CD3mAb、LPS、CD3mAb聯(lián)合LPS,或CD3mAb聯(lián)合不同濃度LPS刺激的不同條件下進行共培養(yǎng)(設(shè)不加刺激空白對照組)。以流式細胞術(shù)檢測細胞膜表面分子CD4和胞

8、內(nèi)細胞因子IL-17及IFN-γ,確定各種刺激條件下,誘導(dǎo)生成的Th17細胞和Th1細胞等亞群占CD4~+T細胞的百分比。
　　2.將分離純化的健康人外周血CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞,分別進行CD4~+T單獨培養(yǎng),CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞直接接觸或非直接接觸共培養(yǎng),采用方法1確定的最佳條件刺激分化,流式細胞術(shù)測定Th17細胞生成比例。
　　3.收集確診RA的活動期患者及健康人外周血,分別采用免疫磁珠

9、法分離純化CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞,以1:1比例共培養(yǎng),采用方法1確定的最佳條件刺激分化,流式細胞術(shù)測定Th17細胞。為探索CD147和整合素在促進Th17細胞分化中的作用,在上述刺激和共培養(yǎng)條件下設(shè)立4種拮抗劑——5A12、HAb18、CsA、cRGD的阻斷實驗。流式細胞術(shù)檢測Th17細胞比例及其表面標志CCR4、CCR6和IL-23R表達,ELISA測定上清中IL-1β、IL-6和IL-17含量。
　　【結(jié)果】<

10、br>　　1.單獨采用LPS或CD3mAb刺激,分別僅能誘導(dǎo)(1.30±0.19)％、(1.10±0.21)％CD4~+T細胞表達IL-17, LPS聯(lián)合CD3mAb刺激顯著增加Th17細胞比例達(2.01±0.46)％(P﹤0.05)。在抗CD3mAb刺激條件下,設(shè)LPS濃度0.1μg/mL,1μg/mL,10μg/mL,隨LPS濃度增加,Th17細胞比例顯著減少(P﹤0.05)。LPS體外刺激3天可誘導(dǎo)Th17細胞生成的比例至(2.

11、13±0.32)％,隨時間推移,Th17細胞減少(P﹤0.05),而Th1細胞在6天達最高比例(17.45±3.04)％。提示低劑量LPS聯(lián)合抗CD3mAb活化的單核細胞可在短時間內(nèi)誘導(dǎo)CD4~+T細胞向Th17細胞分化。
　　2.在實驗1確定的適宜刺激條件下,CD4~+T細胞單獨培養(yǎng)及非直接接觸共培養(yǎng)分別可見Th17細胞比例為(0.61±0.08)％和(1.04±0.36)％,較空白對照,差異無統(tǒng)學意義(P=0.24)。直接接觸

12、共培養(yǎng),刺激后Th17細胞比例顯著增高可達(2.39±0.13)％(P＜0.01)。提示共培養(yǎng)體系中CD4~+T細胞向Th17細胞方向分化依賴與活化的單核細胞直接接觸。
　　3. RA患者外周血的CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞共培養(yǎng)體系中較健康人Th17細胞比例,培養(yǎng)上清IL-17水平,表達表面分子IL-23R、CCR4、CCR6的CD4~+T細胞的比例,及Th17細胞分化相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-6含量,均顯著升高;

13、 CD147抗體、CsA阻斷實驗減少Th17細胞、IL-17、IL-1β、IL-6生成,下調(diào)表達IL-23R的CD4~+T細胞的比例,cRGD阻斷實驗減少IL-17分泌,下調(diào)表達IL-23R的CD4~+T細胞的比例,提示CD147和整合素可能參與CD4~+T與CD14~+單核細胞相互作用誘導(dǎo)Th17細胞分化的機制。
　　【結(jié)論】
　　1.建立了體外誘導(dǎo)Th17細胞的單核細胞與T細胞共培養(yǎng)體系。
　　2.證實了以小室隔離

14、CD4~+T細胞與CD14~+單核細胞直接接觸降低Th17細胞分化比例,提示與活化的單核細胞間的直接接觸作用對誘導(dǎo)Th17細胞分化具有重要意義。
　　3.證實了活動期RA患者外周血的CD4~+T與CD14~+單核細胞共培養(yǎng)體系中Th17細胞及IL-17水平均顯著高于健康對照,提示RA可能與Th17細胞升高相關(guān)。
　　4.發(fā)現(xiàn)了免疫抑制劑CsA對Th17細胞的誘導(dǎo)分化過程具有顯著抑制作用,可能為CsA臨床治療機制提供理論基礎(chǔ)與