小鼠肺間質(zhì)纖維化中巨噬細(xì)胞亞型誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化及CD147在其中的作用.pdf

1、背景：
　　肺間質(zhì)纖維化是一種慢性的、漸進(jìn)的肺間質(zhì)疾病,其特點(diǎn)是大量積累細(xì)胞外基質(zhì),重塑肺結(jié)構(gòu),并伴隨著嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥。它是由多種原因引起的肺間質(zhì)的炎癥性疾病,病變主要累及肺間質(zhì),也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管。肺間質(zhì)纖維化中一部分患者繼發(fā)于系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多肌炎/皮肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎及混合結(jié)締組織病,臨床上也很常見。大部分患肺纖維化的病人將會(huì)在3-8年內(nèi)死于呼吸衰竭。盡管肺間質(zhì)纖維化的患者死亡率很

2、高,但是目前還沒有治療該疾病的有效方法,此病的發(fā)病機(jī)制及發(fā)展進(jìn)程也不清楚。因此,加深對(duì)肺間質(zhì)纖維化機(jī)制,尤其是對(duì)其病程早期階段的認(rèn)識(shí),是該病發(fā)病機(jī)制和治療研究亟待解決的問題。
　　輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一種能夠分泌白介素17(IL-17)的T細(xì)胞亞群,在機(jī)體防御反應(yīng)和自身免疫性疾病中具有重要的意義。它是由Th0細(xì)胞在TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-23的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞,主要分泌IL-17、IL-22等

3、促炎癥因子,RORγ是其重要的轉(zhuǎn)入因子。Th17細(xì)胞在多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起非常重要的作用,如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎性腸病和支氣管哮喘,近幾年來發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化中也有非常重要的作用。
　　單核吞噬細(xì)胞前體經(jīng)微環(huán)境中某些微生物產(chǎn)物和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)能夠發(fā)生分化,并且因誘導(dǎo)因素不同而表現(xiàn)出不同表型和功能特點(diǎn)。它大體可分為兩種不同的亞型,即M1和M2型巨噬細(xì)胞,各亞型的功能差異很大。雖然國內(nèi)外已有很多

4、文獻(xiàn)報(bào)道巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化,但是各亞型對(duì)Th17細(xì)胞的分化的作用還不是很明確。
　　在肺間質(zhì)纖維化中,某些細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的CD147高表達(dá),并且CD147可能促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程。已有文獻(xiàn)報(bào)道,CD147與細(xì)胞因子TGF-β、IL-6等也有一定關(guān)系,因此我們推斷CD147與Th17的分化也是有關(guān)系的。本課題旨在將肺間質(zhì)纖維化、巨噬細(xì)胞亞型、Th17細(xì)胞和CD147分子聯(lián)系起來,闡明肺間質(zhì)纖維化中M1

5、、M2型巨噬細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化之間的關(guān)系及機(jī)制,并研究清楚CD147在其中的作用。這將對(duì)炎癥的研究及治療起到一定的推動(dòng)作用。
　　目的：
　　建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型,并用HAb18G/CD147抗體治療,觀察小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞亞型和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化;從肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺組織中分離M1、M2型巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),并用HAb18G/CD147抗體封閉和慢病毒干涉CD147,觀察Th17細(xì)胞的分化情況,闡明

6、肺間質(zhì)纖維化中M1、M2型巨噬細(xì)胞與Th17細(xì)胞分化之間的關(guān)系及機(jī)制,并研究清楚CD147在其中的作用。
　　方法和結(jié)果：
　　1.HAb18G/CD147抗體治療肺間質(zhì)纖維化小鼠及Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化
　　1.1.肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立及HAb18G/CD147抗體治療
　　9~11周齡的雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:模型組(BLM組)24只、HAb18抗體治療組和治療對(duì)照組,

7、每組各6只。用氣管滴注法建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型,于造模次日起腹腔注射給藥,治療組用HAb18G/CD147抗體(10mg/kg),治療對(duì)照組予同體積的生理鹽水,每日1次。BLM組不予治療。
　　1.2.檢測及研究
　　模型組于注射博來霉素后第4d、7d、14d、28d分批取材,每次每組6只,3只用于肺組織切片,3只用于研磨提取淋巴細(xì)胞。治療組和治療對(duì)照組于連續(xù)給藥后第14天取材。將小鼠組織塊置4％多聚甲醛/0.1PBS固定

8、24h,經(jīng)脫水、石蠟包埋后,制作石蠟切片(切片厚度3μm),HE染色觀察肺組織炎癥改變,Masson染色觀察肺組織纖維化情況。取小鼠肺組織研磨消化后,加入5mL紅細(xì)胞裂解液,冰上裂解10min,然后輕輕加到5mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液(購于Mediatech)上層,2000rmp離心20min,吸取中間層的單核、淋巴細(xì)胞,用于流式分析。提取模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織淋巴細(xì)胞的mRNA,進(jìn)行Real-timePCR

9、檢測。
　　1.3.結(jié)果
　　1.3.1.治療前及治療后小鼠肺組織病理觀察
　　第4d開始BLM組的肺泡間隔逐漸增寬,有少量淋巴細(xì)胞浸潤,也可見少量的、散在的中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞浸潤;第7d,肺間隔增寬明顯,炎癥反應(yīng)加重,有大量淋巴細(xì)胞、少量單核-巨噬細(xì)胞浸潤,膠原纖維沉積增多,第14d,見肺組織結(jié)構(gòu)破壞,瘢痕形成。對(duì)HAb18G/CD147抗體治療小鼠第14d時(shí)的肺組織進(jìn)行切片,HE染色和Masson染色發(fā)現(xiàn)H

10、Ab18G/CD147抗體治療后,小鼠肺間質(zhì)炎癥明顯減輕,間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍膠原纖維沉積減少。BLM組與治療對(duì)照組間相比均未見明顯差異。
　　1.3.2.流式檢測治療前后M1、M2型巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化
　　流式檢測注射博來霉素后第4d、7d、14d、28d的小鼠肺組織中Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)隨著小鼠肺組織病變的增加,其Th17細(xì)胞、M1、M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加,在第14天時(shí),

11、達(dá)到最大值,第28天時(shí),三種細(xì)胞的數(shù)量都有下降,其中Th17細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞下降的較多。
　　流式檢測模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療后的小鼠,M1型巨噬細(xì)胞略有下降,2.70%±0.45%~1.97%±0.36%;M2型巨噬細(xì)胞變化不明顯,4.80%±0.54%~4.94%±0.23%;Th17細(xì)胞明顯下降,3.24%±0.38%~1.50%±

12、0.54%。
　　1.3.3.Real-timePCR檢測治療前后小鼠肺組織淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞因子
　　提取模型組和HAb18G/CD147抗體治療組的小鼠肺組織淋巴細(xì)胞的mRNA,進(jìn)行Real-timePCR,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過抗體治療后的小鼠TGF-β、IL-6、IL-1β都明顯下降,其中TGF-β下降將近一倍。
　　2.肺間質(zhì)纖維化中M1、M2型巨噬細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)作用
　　2.1.M1、M2型巨噬細(xì)胞及CD4

13、+T細(xì)胞的分離
　　取小鼠肺組織研磨消化后,加入5mL紅細(xì)胞裂解液,冰上裂解10min,然后輕輕加到5mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液(購于Mediatech)上層,2000rmp離心20min,吸取中間層的單核、淋巴細(xì)胞,用于流式分析和分選。
　　流式分選:將收取的單核、淋巴細(xì)胞用FITC-CD16/32,PE-CD206和PerCP-CD4標(biāo)記,室溫放置30min,用MOFLO流式分選儀分選。
　　2.2.檢測及研究

14、　　分選之后的M1、M2型巨噬細(xì)胞分別與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng),并加入5ug/mlanti-CD3和10ug/mlanti-CD28刺激,三天后收集CD4T細(xì)胞用于流式分析。
　　流式分析:將共培養(yǎng)之后的CD4T細(xì)胞分離出來,在1uM莫能菌素條件下培養(yǎng)4小時(shí),然后用PE-CCR6標(biāo)記胞外抗原,室溫放置30min;用BDCytofix/Cytoperm和BDPerm/Washkit固定破膜,FITC-IFNγ,PE-IL-17和PerC

15、P-RORγt標(biāo)記胞內(nèi)抗原,4℃放置半小時(shí),PBS洗三遍,流式上機(jī)分析。
　　2.3.結(jié)果
　　2.3.1.M1、M2型巨噬細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用
　　流式分析發(fā)現(xiàn),在與M1共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞中,誘導(dǎo)成的CCR6、IL-17和RORγt分別是與M2共培養(yǎng)的CD4T細(xì)胞的~5(4.96%±0.46%to1.22%±0.21%),~3(3.87%±0.32%to1.24%±0.23%)和~4(2.54%±0.2

16、8%to0.60%±0.15%)。2.3.2CD147在M1型巨噬細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)中的作用
　　。在M1型巨噬細(xì)胞與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,加入2ug/mlCD147/HAb18抗體封閉CD147,3天后,分離出CD4T細(xì)胞,進(jìn)行CCR6染色,標(biāo)記出Th17細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)CCR6的表達(dá)水平在CD147/HAb18抗體封閉組中要低(1.84%±0.45%),而在未加抗體組中的表達(dá)水平要高(4.15%±0.68%)。同樣的結(jié)

17、果,將用慢病毒干涉掉CD147的M1型巨噬細(xì)胞與CD4T細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CCR6的表達(dá)水平在慢病毒干涉組中要低(2.06%±0.48%),而在未干涉組中的表達(dá)水平要高(4.84%±0.72%)。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞對(duì)Th17細(xì)胞的分化有正向促進(jìn)作用,并且CD147通過調(diào)節(jié)促Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子,TGF-β、IL-6和IL-1β,促進(jìn)該過程的發(fā)生。但是,Th17細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程,涉及到多種不