RhaFGF-G-CSF-ZnSO4聯(lián)用對(duì)糖尿病皮膚潰瘍的治療作用及其機(jī)理研究.pdf

1、目的： 探討重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinanthumanacidicfibroblastgrowthfactor，RhaFGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)和微量元素鋅單獨(dú)使用以及聯(lián)用對(duì)糖尿病皮膚潰瘍的治療作用，并對(duì)其機(jī)理做初步研究。 方法： 取SPF級(jí)SD雄性大鼠80只，體重200～230g，飼養(yǎng)于SPF(Spece

2、ficPathogenFree)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件為溫度20℃～27℃，濕度45％～65％。造模前大鼠禁食過(guò)夜，不禁水，確保大鼠禁食12h～16h，隨后按鏈脲佐霉素(Streptozotocin，STZ)55mg/kg單次腹腔注射，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射等體積0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=4.2)。注射10min后給予飼料。注射STZ后48h，用尿糖試紙測(cè)尿糖，當(dāng)其尿糖濃度在3+及以上時(shí)，禁食3h后斷尾取血，用血糖測(cè)定儀測(cè)定血糖濃

3、度。尿糖在3+及以上、血糖值≥16.67mmol/L(300mg/d1)者列入糖尿病模型。糖尿病成模后，表現(xiàn)出多飲、多食、多尿和體重明顯減輕，此時(shí)以鋼絲籠分籠飼養(yǎng)，4只/籠，多飲多食。飼養(yǎng)期間按體重隔日頸背部皮下注射長(zhǎng)效胰島素1U～2U以維持存活。飼養(yǎng)至2個(gè)月后，以5％水合氯醛按0.5ml/100g腹腔注射麻醉，固定后以8％硫化鈉脫毛劑脫毛，用龍膽紫在其背部標(biāo)記出2個(gè)直徑2.4cm的圓形區(qū)域(面積4.52cm2)，以外科手術(shù)剪小心沿標(biāo)記

4、線剪去拿層皮膚，深至筋膜，止血后以無(wú)菌凡士林紗布包扎備用。皮膚造模后單籠飼養(yǎng)。將造模后的存活SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成8組，每組14個(gè)傷口，分別給予RhaFGF(20/cm2)、bFGF(20μg/cm2)、胰島素(1U/300g)、G-CSF(1800·U/cm2)、0.01％ZnSO4(0.1ml/cm2)、生理鹽水(0.1ml/cm2)、RhaFGF/G-CSF/ZnSO4，RhaFGF/G-CSF。隔口換藥一次。實(shí)驗(yàn)以生理鹽水組

5、作為對(duì)照組。在分組給藥后第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天分別拍下皮膚創(chuàng)面的數(shù)碼照片，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)尺用Image-ProPlus5.2軟件進(jìn)行面積計(jì)算。同時(shí)計(jì)算糖尿病皮膚潰瘍面面積、糖尿病皮膚潰瘍面半數(shù)愈合時(shí)間、糖尿病皮膚潰瘍面完全愈合時(shí)間。在給藥后第7天、第14天、第21天每組取兩個(gè)傷口，分別取其潰瘍愈合中心、愈合邊緣以及愈合區(qū)的皮膚組織，以4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行病理學(xué)檢查、新生微血管計(jì)數(shù)、膠原纖

6、維染色，并用免疫組化方法檢測(cè)PCNA、MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)以X±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用One-wayANOVA以及x2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)正態(tài)分布用P-P，Q-Q圖檢驗(yàn)，方差齊性用Levene法檢驗(yàn)。正態(tài)分布且方差齊性者用LSD進(jìn)行兩兩比較。率的分析使用x2檢驗(yàn)，率的比較使用x2分割(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)校正為0.0038)，兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate中的Pearson法。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS12.0。 結(jié)

7、果： 1.糖尿病皮膚潰瘍面積比較情況：RhaFGF/G-CSF/ZnSO4三藥聯(lián)用組在第3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天的殘余潰瘍面積分別為(4.29±0.72)cm2、(3.47±0.38)cm2、(2.62±0.72)cm2、(1.45±0.54.)cm2、(0.69±0.2)cm2、(0.4±0.13)cm2、(0.09±0.08)cm2，與各單藥使用組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，與RhaFGF/

8、G-CSF兩藥聯(lián)用組相比較，RhaFGF/G-CSF/ZnSO4促潰瘍愈合效果優(yōu)于兩藥聯(lián)用組，但僅在第6天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。RhaFGF組與bFGF組相比較，RhaFGF的療效優(yōu)于bFGF組，但兩者未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.半數(shù)愈合時(shí)間及完全愈合時(shí)間：RhaFGF/G-CSF/ZnSO4三藥聯(lián)用組的半數(shù)愈合及完全愈合時(shí)間分別為(10.88±1.85)天，(20.00±1.15)天，半數(shù)愈合時(shí)間與bFGF組、胰島素組、Zn

9、SO4組及牛理鹽水組相比較P＜0.05，其中與生理鹽水對(duì)照組比較P＜0.01。RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組完全愈合時(shí)間與各組比較，均P＜0.05，其巾與RⅠ組、ZnSO4組、生理鹽水組比較，P＜0.01。 3.病理學(xué)檢查：石蠟切片光鏡下觀察顯示RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組潰瘍中心區(qū)域的成纖維細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)血管芽胚密度均與其他各組有明顯差異，近表面出血較多，表皮增生明顯，顆粒層細(xì)胞肥大，基底層結(jié)構(gòu)較為緊密，真皮

10、層中可見有少：旱：的肌纖維生成。RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組潰瘍愈合邊緣區(qū)域的病理切片觀察可見角質(zhì)層基本形成，皮膚附屬器官發(fā)育較為完全，皮脂腺細(xì)胞肥大，毛皮質(zhì)及毛乳頭染色較深，顯示為嗜堿性顆粒較多，顆粒層細(xì)胞肥大消失，變得較為扁平，基底層結(jié)構(gòu)變得比較疏松，真皮層的成纖維細(xì)胞逐漸消失，伊紅著色的膠原纖維充滿真皮層，同時(shí)微血管口徑變粗，可見大量血細(xì)胞存在于血管中，并有血竇形成。 4.微血管計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù)10μm～50μm的微血

11、管數(shù)量，結(jié)果表明RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組第7天、14天、21天的血管數(shù)量分別為19.50±3.11、16.67±1.15、29.00±3.61。第7天時(shí)，三藥聯(lián)用組與單獨(dú)用藥組比較均P＜0.05，第14天與其他各組比較均有差異，P＜0.05。21天時(shí)，三藥聯(lián)用組與RⅠ組、ZnSO4組、NS組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。 5.膠原染色：膠原染色的結(jié)果顯示RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組的細(xì)胞分化較快，潰瘍中

12、心區(qū)域的標(biāo)本中可見紅色著色的成纖維細(xì)胞胞核，與其他用藥組比較，真皮層中可見有少量亮綠著色，顯示細(xì)胞已經(jīng)開始分化并分泌產(chǎn)生膠原纖維。愈合邊緣的染色顯示RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組膠原纖維亮綠著色較深，結(jié)構(gòu)較為致密。 6.PCNA免疫組化結(jié)果：RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組在第7天、14天、21天的陽(yáng)性率(％)分別為80.67±4.16，93.00±4.36，89.00±7.94，免疫組化染色可見有大量棕黑色的陽(yáng)性

13、細(xì)胞核與淡藍(lán)色的胞核，陰性對(duì)照片無(wú)此現(xiàn)象。與其他組比較，7天時(shí)與RhaFGF/G-CSF組、RhaFGF組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與其余組有差異，P＜0.0038。14天和21天RhaFGF/Zn/G-CSF組與RhaFGF/G-CSF組比較無(wú)差異，與其余各組有差異，P＜0.0038(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)校正為0.0038)。 7.TIMP-1免疫組化結(jié)果：免疫組化染色可見有大量細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，陰性對(duì)照片無(wú)此現(xiàn)象。染色部位集中在真皮層與皮下組織

14、交界區(qū)域、顆粒層及真皮層中。RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組在第7天、14天、21天的陽(yáng)性表達(dá)率(％)分別為15.00±1.53、34.33±9.29、46.67±7.09，與其他組比較，在第7天時(shí)與RhaFGF/G-CSF組以及ZnSO4組無(wú)差異，在第14天和第21天，與各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.0038。各組數(shù)據(jù)表明，隨TIMP-1的表達(dá)隨創(chuàng)傷的愈合而逐漸表達(dá)增加。 8.MMP-1免疫組化結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示有大量

15、細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，陰性對(duì)照片無(wú)此現(xiàn)象。RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組在第7天、14天、21天的陰性表達(dá)率(％)分別為3.67±1.53、5.17±2.08、4.33±3.06，在第7天時(shí)與其他用藥組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第14天與RhaFGF組、bFGF組、RⅠ組、NS對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.0038。在第21天統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組與RJ組、G-CSF組、NS對(duì)照組有顯著差異，P＜0.0038

16、。各組數(shù)據(jù)表明，隨著創(chuàng)傷的愈合，在14天左右MMP-1的表達(dá)達(dá)到高峰，此后逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 9.MMP-9：免疫組化結(jié)果在鏡下觀察可見有細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，陰性對(duì)照片無(wú)此現(xiàn)象。 RhaFGF/G-CSF/ZnSO4組在第7天、14天、21天的陽(yáng)性表達(dá)率(％)分別為3.33±1.53、7.33±1.15、9.00±3.61。與其他各組比較在第7天未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在第14天與bFGF組、砌組、G-CSF組、NS對(duì)照組有統(tǒng)

17、計(jì)學(xué)差異，P＜0.0038，在第21天與RhaFGF組、bFGF組、RⅠ組、G-CSF組、NS對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.0038。各組數(shù)據(jù)表明，MMP-9在創(chuàng)傷愈合前期表達(dá)較少，隨著創(chuàng)傷的愈合，其表達(dá)逐漸呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。 10.MMP-1/TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值及其與創(chuàng)傷愈合的關(guān)系：比較各組MMP-1/TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組的比值均低于單藥物使用組，且各用藥組的比值均低于