ZnT3基因敲除對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷的保護(hù)作用.pdf

1、背景：
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷病理生理學(xué)機(jī)制尚未清楚，雖然SAH后興奮性遞質(zhì)釋放引起的興奮性中毒學(xué)說已被證實(shí)，但伴隨GABA釋放的大量Zn離子對(duì)于SAH后早期腦損傷的影響并不清楚。
　　目的：
　　探究ZnT3敲除對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用，為蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦保護(hù)提供新思路。
　　材料和方法：
　　一、材料
　　本次研究用ZnT3雜核小鼠(美國，JaxLab實(shí)驗(yàn)室Slc30a3t

2、m1 Rpa)，由中國醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室池志宏教授慷慨提供。小鼠自由攝食水，飼養(yǎng)條件保持12小時(shí)白夜交替，小鼠自由交配。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┗蛐丸b定和分組
　　采集2月齡鼠尾，通過聚合酶鏈反應(yīng)-凝膠電泳，結(jié)果區(qū)分基因型。保留ZnT3野生型(ZnT-3+/+)和ZnT3基因敲除型(ZnT-3-/-)。實(shí)驗(yàn)用鼠分為WT-Con組（野生對(duì)照組）6只，WT-SAH組（野生蛛網(wǎng)膜下腔組）9只，ZnT3 KO-SA

3、H組（基因敲除蛛網(wǎng)膜下腔出血組）9只。
　?。ǘ┲刖W(wǎng)膜下腔出血模型建立
　　WT-SAH組及ZnT3 KO-SAH組均采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。簡要操作如下:稱取小鼠重量，按照0.6ml/100g，常規(guī)腹腔注射5％水合氯醛注射液麻醉。仰臥位固定于顯微鏡操作臺(tái)上，頸部備皮后常規(guī)碘伏消毒3遍。沿正中線切開皮膚，長約7mm。分離兩側(cè)腺體，游離頸外動(dòng)脈，電凝頸外動(dòng)脈分支，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端用5-0結(jié)扎，中間預(yù)留7-

4、0活結(jié)。在預(yù)留活結(jié)上剪一小口，插入6-0尼龍線。尼龍線經(jīng)頸動(dòng)脈分叉后避過翼鄂動(dòng)脈，遇到突破感后繼續(xù)插入2mm，進(jìn)線總長約1cm(圖1A和1B)，退出尼龍線，縫合創(chuàng)口。WT-Con組進(jìn)行上述操作但不穿破血管。此種方法可以模擬動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血。所有小鼠術(shù)后恒溫飼養(yǎng)，自由攝食。
　?。ㄈ┲刖W(wǎng)膜下腔出血量評(píng)分和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分
　　術(shù)后24小時(shí)處死前對(duì)各組小鼠依據(jù)由Garcia等報(bào)道改良的評(píng)分系統(tǒng)盲法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

5、，同時(shí)準(zhǔn)確記錄各小鼠評(píng)分。小鼠處死后進(jìn)一步對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血量進(jìn)行評(píng)分。處死小鼠后迅速分離大腦。對(duì)小鼠腦底面，主要是Willis環(huán)和基底動(dòng)脈周圍攝取高分辨率圖片。然后依據(jù)Sugawara的方法劃分評(píng)估區(qū)域，并對(duì)每一部分出血量進(jìn)行評(píng)估。記錄每只小鼠評(píng)分。篩選8-12分為實(shí)驗(yàn)取材，消除出血量不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響。
　　（四）海馬HE、Nissl染色及皮質(zhì)Tunel染色
　　取材后4％多聚甲醛固定，-20℃冰凍切片。對(duì)每組按照試劑盒操

6、作進(jìn)行HE、Nissl及Tunel染色。顯微鏡照相后應(yīng)用IPP5.0進(jìn)行圖像分析。，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　在蛛網(wǎng)膜下腔出血量8-12分內(nèi)行為學(xué)變化與出血量呈負(fù)相關(guān);WT-SAH組較WT-Con組小鼠小鼠行為學(xué)有明顯差異，神經(jīng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重;KO-SAH組較WT-SAH組行為學(xué)改善，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少。
　　結(jié)論：
　　ZnT3敲除一定程度上減輕了蛛網(wǎng)膜下腔出血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷，ZnT3敲除后對(duì)蛛網(wǎng)