肝陽上亢證與肝陽化風證大鼠神經內分泌免疫網絡的蛋白質組學研究.pdf

1、目的： 1.復制具有病證結合特點的高血壓肝陽上亢證與出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證動物模型。 2.研究肝陽上亢證與肝陽化風證垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細胞蛋白質的表達規(guī)律，從神經內分泌.免疫系統(tǒng)的蛋白質表達水平探討二證本質內涵，為肝陽上亢證與肝陽化風證開辟新的研究領域。 3.尋找肝陽上亢證與肝陽化風證相同與差異表達的蛋白，揭示同病異證和異病同證的本質內涵。 方法： 1.高血壓肝陽上亢

2、證動物模型的復制：75只SD大鼠隨機分為正常組15只（自由飲水），高血壓肝陽上亢證組60只，采用附子湯灌胃（附子湯的劑量為20 ml/kg-d），同時喂1.5％高滲鹽水的方法，共6周，6周后從激惹程度、結膜充血情況、血壓測定及旋轉時間等方面進行模型評價。 2.出血性中風肝陽化風證動物模型的復制：在成功復制高血壓肝陽上亢證模型基礎上，采用Ⅶ膠原酶腦內定位注射誘導大鼠腦出血復制成出血性中風肝陽化風證模型，從行為學與形態(tài)學觀察評價模型

3、成功與否。 3.缺血性中風肝陽化風證動物模型的復制：在成功復制高血壓肝陽上亢證模型基礎上，用改良線栓法造成大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO），復制成缺血性中風肝陽化風證模型，從行為學與TTC染色評價模型成功與否。 4.蛋白質組學檢測及基因、蛋白質水平驗證：應用雙向凝膠電泳技術（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）分別

4、分離各組垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細胞蛋白質，改良的考馬斯亮藍染色使凝膠中的蛋白質點可視化；掃描凝膠成像，Pdquest圖像分析軟件進行圖像分析并識別差異表達的蛋白質與共同表達的蛋白質；應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）得到相應的肽質量指紋圖譜（pe

5、ptide mass fingerprint，PMF），搜索數據庫進行鑒定，運用RT-PCR與western blotting方法從基因與蛋白質兩方面驗證差異表達蛋白。 結果： 1.動物模型的復制：60只SD大鼠成功復制成高血壓肝陽上亢證模型48只，模型成功率為80％；模型成功后隨機分為高血壓肝陽上亢組14只，出血性中風肝陽化風組17只（實驗中死亡2只）和缺血性中風肝陽化風組17只（實驗中死亡3只）。 2.動物模

6、型的評價：①高血壓肝陽上亢證組大鼠出現(xiàn)不同程度的性情變化，表現(xiàn)為煩躁、易激惹、互相打斗，部分大鼠雙眼結合膜顏色加深變紅，與正常組比較差異有顯著性（P<0.05）；與正常組相比旋轉時間明顯縮短（P<0.05）；隨造模時間延長，血壓逐步上升，至第6周達到高峰，與正常組比較差異有顯著性（P<0.01）；②造模術后12h出血性肝陽化風證組與缺血性肝陽化風證組大部份出現(xiàn)了結膜充血，且其易激惹程度進一步加重，表現(xiàn)為提尾時尖叫、驚跳，甚至咬人或同籠大

7、鼠頻繁打斗，與正常組、肝陽上亢組比較差異有顯著性意義（P<0.05）；旋轉時間較術前更加縮短，且血壓進一步上升，與正常組、肝陽上亢證組比較差異有顯著性（均P<0.05）；腦出血術后神經功能缺損評分>2分的為13只；腦缺血術后神經功能缺損評分>2分的為12只：出血性中風肝陽化風證HE染色示腦內形成直徑3mm左右血腫，光鏡下見出血灶內充滿變性紅細胞、大量中性粒細胞和吞噬細胞浸潤，無正常結構，血腫周圍神經細胞排列紊亂，缺血性中風肝陽化風證TT

8、C染色示缺血區(qū)腦組織顏色蒼白，其余部分染色為均勻紅色，缺血的大鼠腦缺血體積百分比為（15-45％），正常組全腦染色為均勻紅色。 3.垂體、腎上腺、甲狀腺組織及脾淋巴細胞雙向凝膠電泳圖譜的建立和圖象分析：在相同條件下分別對垂體、腎上腺、甲狀腺及脾淋巴細胞總蛋白質各進行了3次雙向凝膠電泳分離，考染顯色后得到背景清晰、分辨率高、重復性好的2-DE圖譜各3塊，其總蛋白質的分布模式非常相似，使用PDQuest軟件對凝膠圖譜進行圖像分析結果

9、顯示，垂體組織的2-DE圖譜的蛋白質點約1100±32個；腎上腺的2-DE圖譜的蛋白質點約800±56個；甲狀腺的2-DE圖譜的蛋白質點約500±17個；脾淋巴細胞的2-DE圖譜約的蛋白質點約1200±24個，大多數蛋白質點在位置和豐度上是一致的，主要分布在pH4-8和Mr20-60kD的范圍內。 4.選取四組中差異表達和共同表達的蛋白質點作進一步的質譜鑒定，從匹配的蛋白質斑點中隨機選取了61個分辨較清楚的點進行MALDI-TO

10、F-MS分析，共有46個蛋白質點得到鑒定，根據NCBI、MSDB數據庫中提供的的信息，這些差異蛋白質的功能涉及抗氧化應激、代謝相關酶、蛋白質合成與降解、細胞骨架相關蛋白、分子伴侶、出凝血相關等，其中類固醇激素合成急性調控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）、泛素C末端水解酶L1（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1，UC

11、H-L1）、二氫嘧啶酶相關蛋白2（Dihydropyrimidinase-related protein2，DRP-2）、硫氧還蛋白過氧化物酶（Peroxiredoxin，PRDX）等可能與肝陽上亢證與肝陽化風證神經內分泌-免疫網絡的相互作用有關。 5.差異蛋白驗證結果： （1）RT-PCR結果顯示：STARmRNA、DRP-2mRNA及PRDX2mRNA在高血壓肝陽上亢證、出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表

12、達均較正常組明顯增強（p<0.01），而在出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達又較高血壓肝陽上亢證組表達增強（P<0.05），出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證兩組間比較比較無明顯差異（P>0.05）；UCH-L1mRNA在高血壓肝陽上亢證、出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達均較正常組明顯減弱（p<0.01），而在出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達又較高血壓肝陽上亢證組表達明顯減弱（P<0

13、.05），出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證兩組間比較無明顯差異（P>0.05），且STARmRNA、DRP-2mRNA、PRDX2mRNA及UCH-L1mRNA在垂體與腎上腺中的表達水平一致。 （2）Western blotting結果顯示：STAR在高血壓肝陽上亢證、出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達均較正常組明顯增強（p<0.01），而在出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達又較高血壓肝陽上

14、亢證組表達增強（P<0.05），出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組兩組間比較無明顯差異（P>0.05）；UCH-L1在高血壓肝陽上亢證、出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達均較正常組明顯減弱（p<0.01），而在出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組表達又較高血壓肝陽上亢證組表達明顯減弱（P<0.01），出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證組兩組間比較無明顯差異（P>0.05），結果與蛋白質組學及RT-

15、PCR研究的結果一致。 結論： 1.成功復制了高血壓肝陽上亢證、出血性中風肝陽化風證及缺血性中風肝陽化風證動物模型，具有病證結合的特點。 2.肝陽上亢證與肝陽化風證的形成過程是一個多蛋白質參與的復雜病理過程，且神經內分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的多個蛋白質表達發(fā)生了明顯的改變，提示二證神經內分泌-免疫網絡出現(xiàn)了明顯的紊亂。 3.肝陽上亢證與肝陽化風證既有相同的蛋白質表達又有差異的蛋白質表達，提示二證既有相同的物質基