健脾化濕顆粒對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸5-HT,CRF及其受體的影響.pdf

1、腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome,IBS）是一種常見的胃腸道功能紊亂性疾病，常常表現(xiàn)為腹痛、腹脹、排便習慣和大便性狀異常。根據(jù)臨床表現(xiàn)形式，IBS可以分為腹瀉型、便秘型、腹瀉-便秘交替型[1]，以腹瀉型較為常見。腹瀉型腸易激綜合征（Diarrhea-prominantirritable bowel syndrome，D-IBS）患者以腹痛、腹瀉為主，并伴有心煩、焦慮、抑郁等神經(jīng)功能失調(diào)癥狀。迄今為止其病因及

2、發(fā)病機制與多種因素有關，尚無法用單一的生理病理機制解釋復雜的IBS癥狀。近年來，相關神經(jīng)胃腸學研究發(fā)現(xiàn)D-IBS與心理應激引起的腦-腸軸功能紊亂有關[2]，并認為腦-腸軸異常可能是導致 D-IBS患者對各種應激反應增強和內(nèi)臟敏感性增加的主要因素。然而，腦-腸軸功能的調(diào)節(jié)又依賴于各種腦腸肽及其受體的表達，其主要興奮遞質(zhì)有組胺、5-羥色胺（5-HT）、P物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關肽（CGRP）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）等；抑制性

3、遞質(zhì)有膽囊收縮素（CCK）、去甲腎上腺素（NE）、血管活性肽（VIP）等，本實驗擬從5-HT、CRF進行研究，其中5-HT是一種單胺類遞質(zhì)，廣泛存在于 CNS和腸道中，在腦-腸傳導中起著及其重要的作用；CRF是一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，是參與應激反應的一個重要因子，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，如腎上腺、胃腸道、脾等。
　　目前西醫(yī)以對癥治療為主，包括瀉藥、止瀉藥、胃腸解痙藥、腸道動力感覺調(diào)節(jié)藥等。在短期內(nèi)這些藥物對癥狀的緩解有

4、一定的療效，但遠期治療效果不太理想，停藥后較易復發(fā)；亦或是有較大的毒副作用。如于2002年正式被美國 FDA批準臨床應用于改善胃腸道癥狀的藥物替加色羅，因其心臟毒性，現(xiàn)已退出市場等等。中醫(yī)藥在緩解癥狀和改善患者生活質(zhì)量方面較西醫(yī)治療有較大優(yōu)勢[3]。健脾化濕顆粒源于臨床驗方，其療效確切。該課題組采用灌服番瀉葉并施加束縛應激[4]的方法建立腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型。前期實驗顯示，健脾化濕顆?？梢燥@著改善和緩解腹瀉型腸易激綜合征大鼠的內(nèi)臟

5、高敏感和胃腸動力異常，并從調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦、脊髓）中5-HT、CRF、CRF1R的變化來研究健脾化濕顆粒治療D-IBS大鼠的作用機制。本實驗從外周（結(jié)腸）系統(tǒng)中腦腸肽（5-HT、CRF）及其受體（5-HT3R、5-HT4R、CRF1R）進行研究，進一步為健脾化濕顆粒治療腹瀉性腸易激綜合征提供實驗數(shù)據(jù)，豐富中醫(yī)藥理論知識。
　　目的：
　　本實驗通過觀察健脾化濕顆粒對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸內(nèi)CRF，CRF1R,5-HT

6、,5-HT3R,5-HT4R的影響，探討健脾化濕顆粒改善D-IBS模型大鼠結(jié)腸運動和內(nèi)臟敏感性的外周作用機制。
　　方法：
　　選用7周齡SPF清潔級SD大鼠72只，隨機分成六組，每組12只，分別為正常組（N）、模型組（MO）、陽性對照組（PC）、健脾化濕顆粒低劑量組（L）、健脾化濕顆粒中劑量組（M）、健脾化濕顆粒高劑量組（H）。實驗前禁食不禁水，除正常組其余各組大鼠前14天分別予以番瀉葉煎劑（0.3 g·mL-1生藥）灌胃

7、。后14天在灌服完番瀉葉煎劑后用透明膠帶束縛大鼠前上肢，胸部及肩部持續(xù)1 h。束縛1 h后模型組予以生理鹽水灌胃；健脾化濕顆粒（低、中、高）劑量組予以健脾化濕顆粒（0.25 g·mL-1、0.5 g·mL-1、1 g·mL-1）劑量灌胃；陽性對照組予以得舒特（3 mg·mL-1）灌胃；正常組大鼠前14天、后14天均予以生理鹽水灌胃，各溶液灌胃量均按照10 mL·kg-1。藥物干預14天后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉處死大鼠，迅速取一段遠

8、端結(jié)腸組織，用生理鹽水清洗干凈后，一部分置于-80℃冰箱里冷凍保存；一部分置于4%多聚甲醛中固定用于檢測待測指標。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠結(jié)腸中五羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（Corticotropin releasing factor，CRF）的含量；免疫組化法（Immunohistochemistry，ICH）檢測結(jié)腸粘膜中CRF，粘膜下層促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1

9、受體（Corticotropin releasing factor receptor1，CRF1R）、5-羥色胺3受體（5-HT3R）、5-羥色胺4受體（5-HT4R）的陽性表達；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法分別檢測CRF、CRF1R、5-HT3R、5-HT4R mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1、健脾化濕顆粒對D-I

10、BS大鼠結(jié)腸5-HT及其受體的影響
　　1.1、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸中5-HT含量的影響
　　與正常組相比，模型組5-HT含量明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地降低大鼠結(jié)腸中5-HT含量（P<0.05）。
　　1.2、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸粘膜下層5-HT3R陽性表達的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸粘膜下層5-HT3R陽性表達量明

11、顯增多（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地降低大鼠結(jié)腸粘膜下層5-HT3R陽性表達（P<0.05）。
　　1.3、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸粘膜下層5-HT4R陽性表達的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸粘膜下層5-HT4R陽性表達量明顯降低（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地升高大鼠結(jié)腸粘膜下層中5-HT4R陽性表達（P<0.

12、05）。
　　1.4、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸5-HT3R mRNA含量的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸中5-HT3R mRNA水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，健脾化濕顆粒低劑量組與之作用相似（P>0.05），健脾化濕顆粒（中、高）劑量組能不同程度地降低大鼠結(jié)腸中5-HT3R mRNA水平（P<0.05）。
　　1.5、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸5-HT4R mRNA含量的影響

13、　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸中5-HT4R mRNA水平明顯降低（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地升高大鼠結(jié)腸中5-HT4RmRNA水平（P<0.05）。
　　2、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸CRF及其受體的影響
　　2.1、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸中CRF含量的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸中CRF含量明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，三個劑

14、量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地降低大鼠結(jié)腸內(nèi)CRF含量（P<0.05）。
　　2.2、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸粘膜CRF陽性表達的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸粘膜中CRF陽性表達含量明顯增加（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地降低大鼠結(jié)腸粘膜內(nèi)CRF含量（P<0.05）。
　　2.3、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸粘膜下層CRF1R陽性表達的影

15、響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸粘膜下層 CRF1R陽性表達量明顯增多（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同程度地降低大鼠結(jié)腸粘膜下層中CRF1R陽性表達（P<0.05）。
　　2.4、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸CRF mRNA含量的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸中CRF mRNA水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，三個劑量（低、中、高）的健脾化濕顆粒能不同

16、程度地降低大鼠結(jié)腸中CRFmRNA水平（P<0.05）。
　　2.5、健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸CRF1R mRNA含量的影響
　　與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸中CRF1R mRNA水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，健脾化濕顆粒低劑量組與之作用相似（P>0.05），健脾化濕顆粒（中、高）劑量組能不同程度地降低大鼠結(jié)腸中CRF1R mRNA水平（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　健脾化濕顆粒改善 D