轉移性大腸癌癌旁組織中microRNA表達譜的研究.pdf

1、目的： 大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在我國最常見的惡性腫瘤中排名第五，且近年來發(fā)病率居高不下并呈上升趨勢。淋巴結轉移是大腸癌最常見的轉移途徑，有無淋巴結轉移或轉移率高低與患者預后密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，無淋巴結轉移的大腸癌患者，其術后5年生存率可達91％，而對于有淋巴結轉移和微轉移的患者，其術后5年生存率可低至10％以下。因此，進一步研究發(fā)現(xiàn)與大腸癌淋巴轉移相關的分子標志及其作用機制并對其深入研究，無疑對大腸癌的早期診斷和治療

2、有著極為重大的意義。microRNA(miRNA)是一類長度為19-25個核苷酸左右的非編碼單鏈小RNA分子，其參與調節(jié)了生物體生命過程中一系列的重要進程，包括細胞增殖、分化和凋亡。目前認為miRNA主要是通過與靶mRNA的部分區(qū)域主要是3’-非翻譯區(qū)的序列互補結合，從而抑制mRNA翻譯或導致mRNA降解進而調節(jié)目的基因表達的。在人體內，miRNA的異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，近幾年來，人們相繼在血液系腫瘤及許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)了一系

3、列miRNA的異常表達。miRNA表達譜芯片是一種高通量，快速地檢測miRNA表達量的手段，目前已有研究利用此技術發(fā)現(xiàn)了一些與大腸癌轉移和預后相關的miRNA。本研究利用miRNA表達譜芯片比較大腸癌伴淋巴結轉移與無轉移患者之間癌旁組織miRNA表達的差異，從癌周微環(huán)境角度探討大腸癌淋巴結轉移的分子機制及與其相關miRNA標記物。 方法： 1.收集2007年10月至2008年1月間溫州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院手術切除的大腸癌癌

4、旁組織標本共6例，其中淋巴結轉移者3例，設為淋巴結轉移組；無淋巴結轉移者3例，設為無淋巴結轉移組。所有患者術前均未接受化療、放療及其他針對腫瘤的特殊治療。術后病理診斷證實均為大腸癌。 2.抽提組織總RNA，將Cy3熒光標記的miRNA與含有723個人類miRNA探針的Aglient表達譜芯片雜交反應。雜交后的芯片使用Agilent microarray熒光掃描儀進行圖象掃描，采用Agilent Feature Extractio

5、n軟件進行數(shù)據(jù)分析，找出淋巴結轉移和無淋巴結轉移組兩組癌旁組織間差異表達的miRNA。利用miRNA表達譜芯片技術來對比分析大腸癌伴淋巴結轉移與無轉移患者之間癌旁組織miRNA表達的差異。 3.為了進一步驗證芯片結果的可靠性，利用Qiagen公司的miScript SYBR Green PCR試劑盒，以U6作為內參照，對差異表達的miRNA分子進行實時定量PCR驗證。使用Applied Biosystem公司的7300定量PCR

6、儀進行檢測。 結果： 1.各組織的總RNA提取結果良好，總RNA的吸光度OD260/OD280值均介于1.8-2.2之間，電泳結果證實提取到的RNA完整性好，無降解及污染現(xiàn)象。 2.miRNA在兩組癌旁組織間的差異性表達 通過比較大腸癌淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組癌旁組織之間的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)兩個miRNA出現(xiàn)差異表達，分別為hsa-miR-129*(P=0.018)與hsa-miR-137(P=0

7、.043)。與無淋巴結轉移組相比，這兩個miRNA在淋巴結轉移組的癌旁組織中表達明顯上調。 3.差異表達miRNA的實時熒光定量PCR驗證 選擇hsa-miR-137在6例大腸癌患者的癌旁組織中進行qRT-PCR檢測。結果顯示，與無淋巴結轉移組相比，hsa-miR-137在淋巴結轉移組的癌旁組織中表達顯著上調，且兩組表達水平差異達到6.6倍，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036)。hsa-miR-137的實時熒光定量PCR結

8、果與芯片結果完全相符。 結論： 我們在有淋巴結轉移的大腸癌和無淋巴結轉移的大腸癌癌旁組織的miRNA表達譜比較中發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNA，找到了兩個淋巴結轉移相關的miRNA，分別是hsa-miR-129*和hsa-miR-137。這兩個差異表達的miRNA將來可能會給臨床上判斷和預測大腸癌患者的淋巴結轉移提供更為有效和準確的分子學依據(jù)，同時對臨床醫(yī)師在治療方案的選擇上可能會起著指導作用。另外，這些miRNA可以通過各