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文檔簡介
1、鐵是人體必需微量元素中含量最多的一種,參與機(jī)體許多重要的生理功能,鐵過多或過少對(duì)機(jī)體都會(huì)造成損害。鐵缺乏對(duì)人體影響被了解的同時(shí),鐵過負(fù)荷對(duì)人體的危害也越來越受到重視。有資料顯示,肝鐵過負(fù)荷可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化;遲發(fā)性皮膚卟啉癥和肝細(xì)胞癌等疾病。
肝臟是機(jī)體鐵貯存的主要部位,在鐵代謝中發(fā)揮著中心和樞紐的作用。為了維持鐵平衡,肝細(xì)胞存在精細(xì)的鐵調(diào)控機(jī)制,可以維持正常生命活動(dòng)所需的鐵量,同時(shí)又會(huì)避免鐵過多蓄積而產(chǎn)生的毒性作用。
2、然而課題組研究發(fā)現(xiàn)心理應(yīng)激可以引起肝鐵蓄積,肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,但機(jī)制尚不明確。
眾所周知,應(yīng)激情況下糖皮質(zhì)激素大量分泌,文獻(xiàn)報(bào)道,糖皮質(zhì)激素能夠調(diào)控大鼠腸道內(nèi)鐵蛋白輕鏈重鏈的表達(dá),增加垂體切除鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的含量,有意義的是,課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激情況下,糖皮質(zhì)激素受體和STAT5與鐵調(diào)節(jié)蛋白1基因啟動(dòng)子位點(diǎn)上的相應(yīng)DNA序列結(jié)合活性增強(qiáng),綜合國內(nèi)外相關(guān)研究,提示心理應(yīng)激情況下的肝鐵蓄積可能與糖皮質(zhì)激素的大量
3、分泌導(dǎo)致鐵調(diào)控蛋白的表達(dá)改變有關(guān)。應(yīng)激在現(xiàn)代社會(huì)無處不在,闡明應(yīng)激肝鐵紊亂的機(jī)制對(duì)防治應(yīng)激損傷具有積極的意義。
目的:了解心理應(yīng)激糖皮質(zhì)激素大量分泌與肝鐵蓄積的關(guān)系,及心理應(yīng)激導(dǎo)致肝鐵蓄積的機(jī)制,為闡明心理應(yīng)激情況下肝鐵代謝紊亂、肝鐵蓄積的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并為防治與肝鐵蓄積相關(guān)的疾病提供線索。
方法:
1.心理應(yīng)激對(duì)大鼠肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
4、 雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、心理應(yīng)激組和足底電擊組,每組10只。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50%~60%;使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食,自然晝夜節(jié)律變化光照。
1.2大鼠心理應(yīng)激模型的制作
采用Communication Box System制作大鼠心理應(yīng)激模型。CommunicationBox System由透明丙烯酸板組成
5、,一半小室(A室)底部鋪板絕緣,另一半小室(B室)通電。在B室的實(shí)驗(yàn)大鼠接受30min/d,足底電擊(電壓90V,電流0.80mA):電擊組大鼠跳躍,尖叫,在A室的實(shí)驗(yàn)大鼠通過視覺聽覺產(chǎn)生恐懼的心理反應(yīng),即為心理應(yīng)激大鼠模型。
1.3大鼠肝組織鐵含量的測定
采用原子吸收分光光度計(jì)(日本日立公司Z-2000型)火焰法測定。100μg/ml鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液(GBW08616)由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。
1
6、.4大鼠肝臟Fn,TfR1,IRP1,IRP2 mRNA表達(dá)量的測定
采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法測定心理應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1,鐵調(diào)節(jié)蛋白1及鐵調(diào)節(jié)蛋白2 mRNA的表達(dá)水平。
1.5大鼠肝臟Fn,TfR1,IRP1蛋白含量的測定
Western blot測定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1以及鐵調(diào)節(jié)蛋白1的蛋白含量。
2.注射糖皮質(zhì)激素對(duì)肝鐵濃
7、度及鐵調(diào)控蛋白的影響
2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(200±10)g。按體重隨機(jī)分為0.9%生理鹽水組,10-9 mol/L皮質(zhì)酮組,10-6 mol/L皮質(zhì)酮組和RU486組,每組10只。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50%~60%;使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食,自然晝夜節(jié)律變化光照。
2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作
大鼠尾靜脈注射0.
8、9%生理鹽水,10-7mol/L皮質(zhì)酮,10-4 mol/L皮質(zhì)酮或10-2mol/L RU486(1h后再注射10-4mol/L皮質(zhì)酮),按照0.1ml/100g bw注射試劑,連續(xù)7天注射后腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,暴露胸腔,剪開右心耳,然后迅速經(jīng)心臟冷PBS沖洗,取出大鼠肝臟存-80℃冰箱備用。
2.3大鼠肝組織鐵含量的測定:同前。
2.4大鼠肝臟Fn,TfR1,IRPlmRNA和蛋白含量的測定:
9、同前。
3.糖皮質(zhì)激素調(diào)控肝細(xì)胞鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)的分子機(jī)制研究
3.1細(xì)胞培養(yǎng)
選用人正常肝細(xì)胞HL7702,RPMI1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、雙抗,培養(yǎng)箱中生長。
3.2氫化可的松干預(yù)細(xì)胞
用精密電子天平稱取3.6247mg的氫化可的松,用無水乙醇稀釋溶解至1ml,配成10-2mol/L,用1640培養(yǎng)液稀釋成10-5,10-6,10-7,10-8,10-
10、9mol/L后加入HL7702細(xì)胞。
3.3 CCK-8法測定肝細(xì)胞活性
棄去培養(yǎng)HL7702細(xì)胞96孔板中的上清,PBS漂洗3次加入CCK-8反應(yīng)液,于37℃孵育2h,使用酶標(biāo)儀450 nn波長處測定吸光度(A)值。以實(shí)驗(yàn)組吸光度值與對(duì)照組的吸光度值之百分比作為細(xì)胞相對(duì)活性。
3.4阻斷HL7702細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體或STAT5
用精密電子天平稱取4.2959mg的RU486,
11、用無水乙醇稀釋溶解至1ml,配成10-2mol/L的RU486,用1640培養(yǎng)液稀釋為10-5mol/L后加入HL7702細(xì)胞,半小時(shí)后再加入10-6mol/L氫化可的松。
用精密電子天平稱取適量STAT5抑制劑溶于DMSO,使終濃度達(dá)到10mg/ml。
3.5肝細(xì)胞IRP1和STAT5 mRNA及蛋白含量的測定
實(shí)時(shí)定量熒光PCR法測定mRNA的表達(dá)水平,Western blot測定蛋白含量的
12、變化。
4.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與處理
采用quantity one圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western條帶進(jìn)行灰度分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用((-X)±S)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,兩組間差異采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn),多組間差異采用單因素方差分析。各組方差齊時(shí),對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組間比較采用Dunnett法,各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn);方差不齊時(shí)采用Dunnett's C檢驗(yàn),P<0.05為
13、顯著性水平,P<0.01為非常顯著性水平。
結(jié)論:
1.連續(xù)7天心理應(yīng)激可以引起大鼠肝臟鐵蛋白表達(dá)減少,而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達(dá)增加,肝細(xì)胞攝入鐵增加引起肝鐵蓄積;肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1含量隨著應(yīng)激天數(shù)增加而增加,通過與IRE結(jié)合轉(zhuǎn)錄后調(diào)控鐵蛋白,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達(dá)可能是心理應(yīng)激情況下肝鐵蓄積的原因。
2.連續(xù)7天每天注射10-6mol/L的皮質(zhì)酮可以引起大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)上調(diào)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1含量
14、增加、鐵蛋白減少、肝臟鐵含量增加,與7天心理應(yīng)激后大鼠肝臟鐵代謝變化一致,結(jié)合以往研究結(jié)果提示心理應(yīng)激時(shí)糖皮質(zhì)激素的大量分泌可能是導(dǎo)致大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達(dá)增加的重要原因。
3.通過整體動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素可以上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)。分別采用特異性糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU486或STAT5抑制劑后,鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)有不同程度的降低,而在培養(yǎng)基中同時(shí)添加上述兩種抑制劑幾乎可完全抑制鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá),表明糖皮質(zhì)
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