LIGHT-LTβR信號(hào)通路在NOD小鼠中的作用.pdf

1、1型糖尿?。═ype1 diabetes mellitus, T1DM）是一種以長期慢性炎癥和胰島β細(xì)胞大量損傷而導(dǎo)致胰島素分泌不足，引起機(jī)體糖脂代謝紊亂為特征的器官特異性自身免疫疾病。T1DM的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，其嚴(yán)重的并發(fā)癥已成為兒童、青少年致殘和早亡的重要因素。因此，T1DM是當(dāng)今急需解決的健康問題之一。引起T1DM的因素多而復(fù)雜，其中T細(xì)胞持續(xù)活化而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷是 T1DM病情發(fā)展中的重要一環(huán)。T細(xì)胞中的CD8+T細(xì)胞

2、致β細(xì)胞死亡的作用已有深入研究，但由 CD4+T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子，尤其是參與T細(xì)胞活化的共刺激分子在該病中的作用機(jī)制仍不是很清楚。深入研究導(dǎo)致 T細(xì)胞活化的共刺激分子在β細(xì)胞免疫損傷中的作用機(jī)制，對(duì)于發(fā)展有效的T1DM防治策略具有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。
　　早期的研究發(fā)現(xiàn)合理封閉一些共刺激途徑可以降低 T1DM的發(fā)生。LIGHT-HVEM/LTβR是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的共刺激分子，多個(gè)研究小組報(bào)道 LIGHT信號(hào)通路

3、通過參與T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性肝炎等多種自身免疫疾病的病理發(fā)生中起著積極的作用。已有報(bào)道認(rèn)為，LIGHT-LTβR信號(hào)途徑可促進(jìn)胰腺內(nèi)淋巴結(jié)的發(fā)育而募集活化 T淋巴細(xì)胞對(duì)β細(xì)胞造成免疫損傷而導(dǎo)致糖尿病的產(chǎn)生；用 LTβR-Ig治療NOD小鼠，早期給藥可預(yù)防胰島炎和TIDM的發(fā)生，胰島炎晚期給藥可逆轉(zhuǎn)胰島炎和延緩糖尿病發(fā)生，提示LIGHT信號(hào)通路在 TIDM的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但 LIGHT信號(hào)通

4、路在T1DM的胰島細(xì)胞凋亡中的直接作用及相關(guān)分子機(jī)制，尚未見報(bào)道。
　　針對(duì)上述研究現(xiàn)狀，本課題結(jié)合現(xiàn)代分子遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的前沿技術(shù)與方法，以LIGHT-/-NOD小鼠為模式動(dòng)物和以MIN6細(xì)胞株為主要細(xì)胞模型，從在體（in vivo）和離體（in vitro）等多個(gè)方面，探討LIGHT信號(hào)通路在T1DM發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，擬解決以下幾個(gè)問題：1、動(dòng)態(tài)檢測 NOD小鼠胰組織LIGHT及其受體HVEM、LTβR的

5、表達(dá)以及外周血中相關(guān)細(xì)胞因子的分泌情況，探討LIGHT信號(hào)通路以及有關(guān)細(xì)胞因子的分泌與T1DM病情發(fā)展的相關(guān)性；2、建立LIGHT-/- NOD小鼠動(dòng)物模型，通過生化指標(biāo)檢測、胰腺病理分析、小鼠糖尿病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)、細(xì)胞因子分泌等觀察LIGHT信號(hào)缺失（LIGHT-/-NOD小鼠）時(shí)，NOD小鼠糖尿病病情變化。通過對(duì)比分析，明確 LIGHT途徑在胰島β細(xì)胞免疫損傷中的作用；3、以NOD小鼠胰島素瘤細(xì)胞株MIN6和Bal b/c小鼠的原代胰

6、島細(xì)胞為模型，分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，利用MTT、FCM等技術(shù)觀察LIGHT途徑對(duì)胰島細(xì)胞存活及凋亡的影響；4、采用Western blot或免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)檢測目標(biāo)基因（STAT1、NF-κB、Bcl-2家族、Caspase家族、PARP等）的蛋白表達(dá)水平，研究闡明 LIGHT信號(hào)通路誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。預(yù)期的研究結(jié)果不但有助于闡明胰島β細(xì)胞的有關(guān)損傷機(jī)制，并且可為T1DM的臨床治療研究提供

7、新的思路和方法。
　　第一部分，LIGHT及受體的表達(dá)隨NOD小鼠糖尿病病情發(fā)展的變化
　　目的：探討LIGHT及受體HVEM、LTβR的表達(dá)以及細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的分泌變化與T1DM發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
　　方法：4周齡雌性NOD小鼠（n=30）飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，在無任何干預(yù)條件下，定期監(jiān)測血糖、胰島素水平。一周內(nèi)連續(xù)兩次檢測非空腹血糖水平≥13.8mmol/L的小鼠診斷為糖尿病，觀察NOD小鼠自發(fā)產(chǎn)生糖

8、尿病的情況；分別隨機(jī)取未產(chǎn)生糖尿病、糖尿病發(fā)病1周、糖尿病發(fā)病2周、糖尿病發(fā)病4周的NOD小鼠各3只，處死收集血清并提取小鼠胰腺總RNA和總蛋白，采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測LIGHT及其受體HVEM、LTβR的表達(dá)；ELISA法檢測血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4）分泌。
　　結(jié)果：30周齡時(shí)，NOD小鼠糖尿病累積發(fā)病率為81.5％（22/27）；Real-time PCR

9、和Western blot結(jié)果顯示，糖尿病發(fā)病4周的NOD小鼠胰腺組織LIGHT、LTβR和HVEM的表達(dá)較未產(chǎn)生糖尿病組明顯上調(diào)（P<0.05）。血清中Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌明顯增加，而Th2細(xì)胞因子IL-4分泌減少。
　　結(jié)論：NOD小鼠發(fā)生糖尿病時(shí)，LIGHT、LTβR和HVEM表達(dá)明顯上調(diào)，血清中促炎癥細(xì)胞因子IFN-γ分泌增加，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-4分泌減少，上述因素與T1DM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　第二部分

10、，LIGHT途徑信號(hào)缺失對(duì)NOD小鼠糖尿病病情的影響
　　目的：觀察LIGHT信號(hào)缺失時(shí)NOD小鼠（LIGHT-/-NOD小鼠）糖尿病病情變化，通過對(duì)比分析明確LIGHT途徑在胰島β細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法：將LIGHT-/-（LIGHT KO）小鼠與NOD小鼠進(jìn)行配對(duì)得到LIGHT+/-NOD子代，再將其與NOD小鼠連續(xù)回交十代以上，LIGHT+/-NOD子代再自交，即可得到LIGHT-/-NOD小鼠。4周齡LIGHT

11、-/-NOD小鼠（n=25）和對(duì)照同齡NOD小鼠（LIGHT＋/＋NOD小鼠）（n=25）飼養(yǎng)26周，動(dòng)態(tài)檢測2組小鼠的體重、血糖，利用腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）分析小鼠體內(nèi)胰島素活性情況，并統(tǒng)計(jì)小鼠的糖尿病累積發(fā)病率。兩組隨機(jī)取11周齡和20周齡小鼠各5只處死，收集血清，采用ELISA法檢測血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的分泌；HE法染色胰腺組

12、織對(duì)胰島炎進(jìn)行分級(jí)；胰島原位細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)（TUNEL法）觀察胰島細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：LIGHT-/-NOD小鼠與LIGHT+/+NOD小鼠相比，糖尿病的累積發(fā)病率顯著降低（LIGHT-/-NOD組：13.3％，2/15；LIGHT+/+NOD組：73.3％，11/15）；LIGHT-/-NOD小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)無異常，而對(duì)照組 IPGTT明顯減退；LIGHT-/-NOD小鼠胰島絕對(duì)數(shù)目明顯多于對(duì)照組，胰島炎以零級(jí)

13、、一級(jí)為主，對(duì)照組胰島炎以二至四級(jí)為主；LIGHT-/-NOD小鼠未見明顯的胰島細(xì)胞凋亡；LIGHT-/-NOD小鼠血清中，與1型糖尿病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子IFN-γ水平顯著低于對(duì)照組，保護(hù)β細(xì)胞的抑制炎癥細(xì)胞因子IL-4水平稍高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：（1）LIGHT信號(hào)通路信號(hào)缺失時(shí)可降低炎性細(xì)胞因子IFN-γ的分泌，改善NOD小鼠的胰島炎癥；（2）LIGHT信號(hào)缺失時(shí)可減輕胰島細(xì)胞凋亡程度，改善葡萄糖耐量異常，降低

14、 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率。
　　第三部分，LIGHT-LTβR信號(hào)通路對(duì)胰島細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：探討LIGHT是否直接參與炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡。
　　方法：培養(yǎng) NOD小鼠胰島素瘤 MIN6細(xì)胞株和原代胰島細(xì)胞。分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，以rmTNF-α為陽性對(duì)照。采用MTT法檢測細(xì)胞存活情況；Hoechst33258染色細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化；FCM

15、檢測細(xì)胞凋亡百分率；DNA ladder電泳檢測細(xì)胞DNA的片段化等，以此分析LIGHT對(duì)胰島細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用抗LTβR或HVEM多抗阻斷LIGHT途徑，用MTT和FCM法觀察胰島細(xì)胞活力和凋亡的變化，進(jìn)一步明確LIGHT途徑對(duì)胰島細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：LIGHT或 IFN-γ單獨(dú)作用時(shí)，僅對(duì)胰島細(xì)胞產(chǎn)生輕微的毒性作用，但 LIGHT聯(lián)合 IFN-γ處理細(xì)胞，兩者的作用增強(qiáng)具有協(xié)同性且呈時(shí)間依賴性地明顯抑制了細(xì)胞活力。M

16、IN6細(xì)胞經(jīng) LIGHT和IFN-γ聯(lián)合處理后，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則瓦片狀變圓甚至漂浮，細(xì)胞密度顯著降低；細(xì)胞核固縮、呈致密濃染，出現(xiàn)凋亡小體；細(xì)胞核內(nèi)基因組 DNA出現(xiàn)明顯的片段化；細(xì)胞早期凋亡率顯著增加，但壞死或晚期凋亡率變化不明顯。運(yùn)用抗 LTβR的多抗阻斷 LIGHT途徑后，能明顯增加胰島細(xì)胞的活力，降低 LIGHT聯(lián)合 IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)論：LIGHT主要結(jié)合受體LTβR，直接參與了炎癥細(xì)胞因子IFN-γ誘

17、導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡；LIGHT與IFN-γ的作用存在協(xié)同效應(yīng)。
　　第四部分，LIGHT-LTβR信號(hào)通路誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
　　目的：探討LIGHT-LTβR通路介導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡中所涉及的下游基因表達(dá)變化，進(jìn)一步明確LIGHT途徑致胰島細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)NOD小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞株，分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，采用Western blot或免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)檢

18、測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT1的蛋白表達(dá)水平；檢測線粒體內(nèi)Cyto C的釋放；分析凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2家族（Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak和Bid）以及凋亡執(zhí)行者Caspase家族（Caspase-3,-8,-9）和Caspase作用底物PARP等基因在不同時(shí)相點(diǎn)的蛋白表達(dá)變化。分別利用NF-κB、STAT1、Caspase、Caspase-3的特異抑制劑 PDTC、Fludarabine、Z-VAD-FMK、Ac-DEV

19、D-CHO預(yù)先處理細(xì)胞影響信號(hào)傳遞，再用相應(yīng)細(xì)胞因子處理，MTT、FCM等技術(shù)檢測細(xì)胞的存活或凋亡情況，Western blot技術(shù)檢測Bcl-2家族主要成員的蛋白表達(dá)變化；利用Caspase-3活性測定試劑盒檢測Caspase-3活性。免疫組織化學(xué)法觀察LIGHT-/-NOD小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)和Caspase-3的活化情況。
　　結(jié)果：LIGHT聯(lián)合IFN-γ作用于MIN6細(xì)胞，能明顯激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT1；

20、凋亡調(diào)控因子Bcl-2家族的抗凋亡成員Bcl-XL表達(dá)下調(diào)，促凋亡成員Bak和Bax上調(diào)；凋亡執(zhí)行者Caspase家族成員Caspase-3,-8,-9被剪切活化，Caspase作用底物PARP被裂解失活；NF-κB、STAT1的特異抑制劑PDTC、Fludarabine逆轉(zhuǎn)了由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的Bcl-XL的表達(dá)下調(diào)和Bax、Bak的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)。LIGHT-/-NOD小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)下調(diào)，Caspase-3的活化被