Wnt信號通路在紫杉醇引起小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)損傷中的作用.pdf

1、研究背景：
　　感音神經(jīng)性聾是一種較為常見的聲波感受和聲波傳導(dǎo)障礙性疾病，多為重度耳聾。該病的病變常常發(fā)生于柯蒂氏器的內(nèi)外毛細(xì)胞、聽神經(jīng)及各級聽中樞，患者對于聲音的感受與神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)發(fā)生障礙，從而引起聽力的下降。感音神經(jīng)性耳聾極大的影響了患者的生活質(zhì)量。感音神經(jīng)性耳聾分為感音性耳聾（病變位于毛細(xì)胞，又稱耳蝸性聾）和神經(jīng)性耳聾（病變位于聽神經(jīng)及其傳導(dǎo)通路，又稱蝸后性聾）。蝸后性耳聾由于神經(jīng)細(xì)胞的缺乏自我修復(fù)的能力而很難治愈。對于感

2、音神經(jīng)性聾的恢復(fù)策略，最新的探索表明干細(xì)胞植入是潛在的治療手段。干細(xì)胞具有多向分化能力，有分化為新的毛細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和支持細(xì)胞的潛能。許多研究都表明，Wnt信號通路對于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖發(fā)揮著決定性作用。并且，Wnt信號通路的激活有可能可以使非神經(jīng)元細(xì)胞再次進入細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞，這就使得治療蝸后性聾成為了可能。
　　Wnt信號通路是一種在進化中高度保守的信號通路，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌

3、的與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)從而影響著極細(xì)胞、干細(xì)胞等的細(xì)胞增殖、分化與凋亡的過程。通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Wnt信號通路分為兩種，經(jīng)典的Wnt信號通路和非經(jīng)典的Wnt信號通路。β-連環(huán)蛋白的富集與入核是經(jīng)典Wnt信號通路激活的標(biāo)志。β-連環(huán)蛋白入核后與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)。而非經(jīng)典的Wnt信號通路，不依賴于β-連環(huán)蛋白，是由其他的一些蛋白或離子參與構(gòu)成。
　　耳蝸螺旋

4、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺失可引起神經(jīng)性耳聾的發(fā)生。而有大量研究表明，耳毒性藥物、噪聲、缺氧、衰老等常見損傷，均可造成小鼠耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，造成耳聾。而目前對于耳毒性藥物的研究，較多集中在順鉑等藥物。紫杉醇由于其與順鉑常常聯(lián)合使用，其耳毒性往往為順鉑所掩蓋，研究較少。而研究也表明紫杉醇確實具有神經(jīng)毒性，可以猜測紫杉醇的耳毒性是對耳的神經(jīng)細(xì)胞造成了影響。螺旋神經(jīng)節(jié)作為聽覺通路的第一級神經(jīng)元，有理由懷疑紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)有損傷作用而這

5、一作用正是它耳毒性的原因。本研究通過組織培養(yǎng)的方式來探究紫杉醇對于螺旋神經(jīng)節(jié)是否具有獨立的損傷作用，并探討Wnt信號通路對于紫杉醇的作用是否具有一定的影響。
　　實驗?zāi)康模?br>　　以C57BL/6小鼠作為研究對象，探討紫杉醇本身是否對小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生獨立的損傷作用，若有損傷，則進一步探討其機制及Wnt信號通路在此過程中的作用。
　　實驗方法：
　　1.選取出生后3天(p3)野生型的C57BL/6品系小鼠為研究

6、對象，取小鼠耳蝸中轉(zhuǎn)（帶螺旋神經(jīng)節(jié)）分組進行原代培養(yǎng)。
　　2.分別使用不同濃度紫杉醇培養(yǎng)，利用MTT法測定細(xì)胞存活程度，并選取合適濃度進行進一步實驗。將小鼠耳蝸中轉(zhuǎn)隨機分為四組，分別使用培基（不加藥的空白對照）、紫杉醇、紫杉醇+Wnt信號通路激動劑(Wnt3a)、紫杉醇+Wnt信號通路抑制劑(IWP2)來處理中轉(zhuǎn)（帶螺旋神經(jīng)節(jié)）48h，之后分別進行免疫熒光染色和TUNEL染色，觀察螺旋神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維的變化。使用蛋白印跡試驗(W

7、estern blot)來印證免疫熒光染色的實驗結(jié)果。
　　3.紫杉醇腹腔注射一月齡小鼠，測聽后解剖，取耳蝸制作冰凍切片進行免疫熒光染色，觀察螺旋神經(jīng)節(jié)的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果顯示，1μl紫杉醇即可造成細(xì)胞存活率的下降，紫杉醇對螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷呈現(xiàn)濃度依賴，后續(xù)實驗選用30μl濃度進行。免疫熒光染色顯示，紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)纖維數(shù)量減少。
　　2.免疫熒光染色顯示紫

8、杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)破壞，出現(xiàn)了胞質(zhì)致密，染色質(zhì)邊集，核固縮及凋亡小體等凋亡表現(xiàn)。而TUNEL染色證實了凋亡的存在。
　　3.免疫熒光染色顯示紫杉醇組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3染色陽性。蛋白印跡試驗也證實了Caspase-3的表達(dá)增多。
　　4.加入Wnt信號通路激動劑組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量介于對照組和紫杉醇組之間，形態(tài)較紫杉醇組稍好，神經(jīng)纖維基本整齊排列。加入抑制劑組螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞數(shù)量大量少，形態(tài)破壞