新型化學單體藥物AFI及Gs-Rd腦保護作用的藥效學研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性腦血管病是導致人類死亡和致殘的最嚴重疾病之一，盡管大量的科研人員在此領(lǐng)域進行了不懈的研究，但除了溶栓治療之外，還沒有任何一種治療措施及藥物被臨床驗證療效確實可靠。由于溶栓治療的時間窗很短，所以目前尋找一種確切并行之有效的神經(jīng)保護劑成為較迫切的任務。
　　本實驗室長期致力于尋找和篩選具有腦保護作用的藥物和措施。由于腦缺血再灌注損傷是由一連串的有害級聯(lián)反應導致的，涉及多個病理環(huán)節(jié)，既往研究已證實針對某一單一

2、環(huán)節(jié)的神經(jīng)保護劑其臨床療效均不確切，因此神經(jīng)保護劑聯(lián)合應用或多作用靶點藥物的研究成為當前腦保護研究的一種新途徑。
　　自由基損傷一直是腦缺血損害中的重要病理環(huán)節(jié)。在新藥靶點研究中，針對自由基損傷的藥物很可能成為腦保護新的候選藥物。自由基分為氧自由基（OFR）和氮自由基（NFR）。氧自由基主要包括超氧陰離子（·O2－）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·HO）。氮自由基主要指內(nèi)源性一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）及由NO與·O2

3、－反應所生成的過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOOˉ）。
　　內(nèi)源性NO在腦缺血再灌注損傷中的作用主要取決于合成NO的一氧化氮合酶(NOS)的類型，盡管由內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS)在缺血早期合成的少量NO可起到一定的神經(jīng)保護作用，但由神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在再灌注過程中大量產(chǎn)生的NO的神經(jīng)毒性作用使得內(nèi)源性NO在腦缺血損害中主要發(fā)揮負面效應。最新有研究提示外源性N

4、O可抑制由內(nèi)源性NO介導的c-junN末端激酶3(JNK3)磷酸化所導致的神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生保護作用，此外，外源性NO還可促進血管形成及神經(jīng)細胞分化來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。同樣有大量研究證實腦缺血再灌注過程中氧自由基爆發(fā)性釋放在腦缺血再灌注損傷中扮演了多重有害作用，而氧自由基清除劑可通過清除氧自由基發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用。
　　以往針對自由基的新藥研發(fā)均是將氧自由基與氮自由基兩者分割開來分別進行。我們根據(jù)趨利避害，扶正抑邪的理念，前期已利

5、用氧自由基清除劑阿魏酸（FA,圖1A）和外源性NO供體單硝酸異山梨醇酯（ISMN,圖1B）這兩種藥物設計并合成了可同時清除氧自由基和釋放外源性NO的雙靶點藥物乙酰阿魏酸單硝酸異山梨醇酯（acetylferulaicisosorbide，AFI，圖2）,本研究旨在研究其腦保護作用并探討相關(guān)機制。
　　中藥單體人參皂甙Rd（Gs-Rd）是用于治療缺血性腦血管病的國家一類新藥，目前正在進行臨床三期研究?；钛愔兴巻误w川芎嗪、葛根素都已被

6、大量研究證實具有腦保護效應，人參皂甙Rd與川芎嗪、葛根素聯(lián)合應用后是否能發(fā)揮更加強大的腦保護作用值得進行進一步研究。
　　本研究分兩部分，實驗一：研究可在體內(nèi)同時清除OFR和外源性釋放NO的雙靶點藥物——乙酰阿魏酸單硝酸異山梨醇酯（AFI）在腦缺血再灌注損傷中的保護效應，并探討其抑制神經(jīng)元凋亡的相關(guān)機制。實驗二：探討中藥單體人參皂甙Rd與葛根素和(或)川芎嗪聯(lián)合應用的腦保護效應。
　　實驗一，AFI的腦保護效應及機制研究

7、r>　　目的：
　　AFI對腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制進行研究
　　方法：
　　1、AFI對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　60只SD大鼠，隨機分為6組：對照（control）組，乙酰阿魏單硝酸異山梨醇酯（AFI）組，單硝酸異山梨醇酯（ISMN）組，阿魏酸鈉（SF）組，阿魏酸鈉+乙酰單硝酸異山梨醇酯（SF+ISMN）組，依達拉奉（edavarone）組。各組動物制備右側(cè)MCAO模型，各給藥組均于再

8、灌注前10min腹腔注射相應藥物，對照組給予相應體積的溶劑（1ml,20％丙酮）。再灌注后72h神經(jīng)功能學評分，并處死動物，取腦行2，3，5-氯化三苯四哇(TIC)染色，以測量腦梗死容積。
　　2、AFI腦保護作用的劑量效應關(guān)系研究
　　40只SD大鼠，隨機分為四組：對照組，AFI1mg/kg組，AFI3mg/kg組，AFI9mg/kg組。各組動物制備右側(cè)MCAO模型，均于再灌注前10min給予相應劑量的AFI（1，3，9m

9、g/kg）或溶劑。再灌注后72h神經(jīng)功能學評分，并處死動物，取腦行2，3，5-氯化三苯四哇(TIC)染色，以測量腦梗死容積。
　　3、AFI對腦缺血再灌注損傷后caspase-3活性的影響
　　24只SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組，對照組和AFI組，各組動物制備右側(cè)MCAO模型（假手術(shù)組不栓線，其余操作與其他兩組相同），均于再灌注前10min給予AFI3mg/kg或溶劑，再灌注后24h處死動物，分別取半暗帶皮層和紋狀體行casp

10、ase-3活性測定。
　　4、AFI對神經(jīng)元凋亡的影響
　　36只SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組，對照組和AFI組，各組動物制備右側(cè)MCAO模型，均于再灌注前10min給予AFI3mg/kg或溶劑，分別于再灌注后4h和24h經(jīng)左心室進行灌注固定，石蠟包埋切片，行TUNEL染色，每組6只動物，高倍鏡下在相應部位取4個視野行TUNEL染色陽性神經(jīng)元計數(shù)，計算均數(shù)及標準差。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)功能學評分及腦梗死容積測

11、定
　　再灌注后72h，相比于對照組，AFI組，SF組，SF+ISMN組，edaravone組神經(jīng)功能學均有改善(P<0.05)，其中edaravone組改善最明顯(P<0.001)，AFI組次之(P<0.01)，而ISMN組與對照組相比無明顯統(tǒng)計學差異。再灌注后72h，相比于對照組，AFI組，SF組，SF+ISMN組，edaravone組梗死容納百分比均有明顯下降(P<0.05)，其中edaravone組梗死容積最小(P<0.0

12、01)，AFI組次之(P<0.01)，而ISMN組與對照組相比無明顯統(tǒng)計學差異。
　　2、劑量效應關(guān)系
　　再灌注后72h,AFI3mg/kg組及AFI9mg/kg組均可以提高神經(jīng)功能學評分(P<0.05)，減少腦梗死容積(P<0.05)，AFI1mg/kg組神經(jīng)功能學評分及腦梗死容積百分比與對照組相比并無明顯統(tǒng)計學差異。
　　3、AFI對腦缺血再灌注損傷后caspase-3活性的影響。
　　再灌注后24h，想比

13、于對照組，AFI可以明顯降低半暗帶皮層和紋狀體的caspase-3活性(P<0.01)。
　　4、AFI對神經(jīng)元凋亡的影響
　　相比于對照組，再灌注后4h，AFI可以明顯減少半暗帶皮層和紋狀體TUNEL染色陽性神經(jīng)元的數(shù)目(P<0.05)，再灌后24h減少更明顯(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　AFI可以改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能，降低腦梗死容積，進一步研究發(fā)現(xiàn)其可以通過降低caspase-3的活性，

14、減少神經(jīng)元的凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　實驗二，Gs-Rd及其聯(lián)合用藥的腦保護效應研究
　　目的：
　　探討人參皂甙Rd及人參皂甙Rd與川芎嗪和(或)葛根素聯(lián)合應用是否具有腦保護效應并比較單獨使用人參皂甙Rd與聯(lián)合用藥之間的保護效應有無差異。
　　方法：
　　50只雄性SD大鼠隨機分為5組(每組10只)。各給藥組按設定時間和劑量分別單獨或聯(lián)合腹腔注射相應藥物，對照組給予相應體積的溶劑（20％丙二醇1ml）。

15、各組行局灶性腦缺血，2h后恢復灌注至72h。在再灌注后72h進行神經(jīng)功能評分(NBS)，72h評分后取腦行TTC(2,3,5-氯化三苯四唑)染色計算腦梗死容積百分比。
　　結(jié)果：
　　單獨使用人參皂甙Rd及人參皂甙Rd與川芎嗪和(或)葛根素聯(lián)合使用均能顯著改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能評分(P<0.05)，減少腦梗死容積(P<0.05)，各給藥組間相比均無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　單獨使用人參皂甙R