骨髓及其動員干細胞改善梗塞心肌功能的旁分泌機制研究.pdf

1、本文就骨髓及其動員干細胞改善梗塞心肌功能的旁分泌機制進行了研究，主要從以下幾部分展開： 第一部分： HIF-1α介導的骨髓干細胞高表達VEGF和iNOS對心肌細胞保護的體外研究目的：探討B(tài)MSCs是否通過HIF-1α信號通路誘導VEGF和iNOS的高表達，在低氧環(huán)境中保護心肌細胞抵抗凋亡。方法：從GFP轉基因小鼠分離培養(yǎng)BMSCs。采用體外BMSCs和心肌細胞低氧共培養(yǎng)(1％O2)或H2O2(200μmol)處理模擬體內(nèi)

2、心肌梗塞氧應激損傷。以LDH釋放、MTT攝取、DNA斷裂、膜聯(lián)蛋白V陽性細胞做為細胞損傷指標。ELISA測定BMSCs總HIF-1α、活性HIF-1α蛋白表達及VEGF的釋放。實時定量PCR測定BMSCs中HIF-1α、VEGF和iNOS的基因表達。熒光免疫細胞化學觀察HIF-1α蛋白定位。結果：心肌細胞低氧暴露30小時，LDH釋放增加，MTT攝取降低，該現(xiàn)象可因與BMSCs的共培養(yǎng)得到糾正；同時低氧或H2O2處理所致的心肌細胞凋亡也隨

3、之減少。在低氧條件下BMSCs中總HIF-1α蛋白及其激活型蛋白的表達增加，并易位至細胞核及核周區(qū)域，同時伴隨VEGF和iNOS的表達增加。HIF-1α蛋白的增加及易位可被HIF-1α抑制劑2-ME2(5μmol)抑制。而且，VEGF和iNOS的分泌以及BMSCs對心肌細胞的保護作用均可被HIF-1α抑制劑2-ME2或HIF-1α中和抗體(200ng/ml～3200ng/ml)所抑制。另外，外源性給予VEGF(12.5ng/ml～100

4、ng/ml)可復制對心肌細胞的保護作用，并呈劑量依賴性。BMSCs對心肌細胞的保護作用也可被選擇性iNOS抑制劑1400W(10mg/L)和非選擇性NOS抑制劑L-NAME(200μmol/L)所抑制。不過，未發(fā)現(xiàn)NO供體SNAP(300μmol/L)與BMSCs在對心肌細胞的保護作用上有協(xié)同作用。結論：BMSCs通過激活HIF-1α信號通路誘導保護性因子VEGF和iNOS的高表達，從而在低氧環(huán)境中保護心肌細胞抵抗凋亡。 第二部

5、分骨髓干細胞條件培養(yǎng)基改善心肌梗塞大鼠心功能的體內(nèi)研究 目的：以大鼠急性心肌梗塞動物模型為基礎，體內(nèi)移植BMSCs條件培養(yǎng)基，探討B(tài)MSCs改善缺血心肌功能的旁分泌機制。方法：LAD結扎后大鼠隨機分為5組，在缺血區(qū)周圍分5點即刻心肌內(nèi)分別注射60μl①生理鹽水(Ns)；②濃縮培養(yǎng)基對照(cM)；③濃縮BMSCs正常氧培養(yǎng)基(BMSCs-cNM)；④濃縮BMSCs低氧培養(yǎng)基(BMSCs-cHM)；⑤含1.5×106BMSCs的生理

6、鹽水(BMscs)。超聲心電圖觀察心功能、三色染色分析心臟梗塞面積、TUNEL染色分析凋亡細胞、免疫組化觀察血管形成。結果：與其它各組比較，BMSCs-cHM可有效改善缺血心肌功能，減少心肌梗塞面積，減少凋亡細胞，促進血管形成。結論：BMSCs通過分泌細胞保護性因子抵抗細胞凋亡，減少心肌細胞損失，減少梗塞面積，改善心肌功能。BMSCs通過旁分泌效應間接促進血管發(fā)生可能為心肌修復的另一機制。 第三部分骨髓動員干細胞改善缺血心肌功能

7、與GATA4的相關性研究 目的：探討經(jīng)心肌梗塞激活的MPCs是否通過高表達GATA4，從而更有利于參與心肌修復。方法：MPCs分離自經(jīng)LAD結扎的GFP轉基因小鼠心臟血。野生型小鼠經(jīng)LAD結扎后隨機分為三組，心肌內(nèi)植入MPCs、BMSCs或DMEM做為對照。心臟超聲測定心功能，三色染色法檢測梗塞面積。FCM分析MPCs和BMSCs細胞表型。常規(guī)PCR或實時定量PCR做基因表達分析。ELISA測定血清G-CSF分泌?；蛐酒治鲛D

8、染了GATA4的BMSCs的基因譜。免疫熒光檢測細胞的轉分化。結果：缺血心肌G-CSF表達增加，血清G-CSF增加與循環(huán)血MPCs的增加呈正相關。MPCs與BMSCs細胞表面標記相似，但MPCs高表達GATA4。轉染了GATA4的BMSCs的基因譜顯示GATA4上調(diào)一系列心血管發(fā)育相關基因、生長因子及抗凋亡蛋白Bcl-2。MPCs移植明顯改善心功能，減少梗塞面積。更為重要的是，體外實驗顯示相對于BMSCs，MPCs更有效的保護心肌細胞抵