木豆葉芪類提取物及其合成類似物調節(jié)膽固醇代謝和血管保護作用的機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病最重要的發(fā)病因素。在動脈粥樣硬化的誘發(fā)因子中，高脂血癥是一個主要的獨立危險因素。所以從藥用植物中尋找具有降血脂作用的天然化合物，并研究其作用機理是近年來的研究熱點，具有重大的應用前景和社會效益。在對高脂血脂誘發(fā)動脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoprotein-cholestero，LDL-C)是主要的致病因子之一。近期的研究表明膽固

2、醇的逆向轉運過程(reversecholesteroltransport，RCT)在改善血脂代謝，防治動脈粥樣硬化中的作用越來越重要。RCT過程能夠促進外周組織膽固醇的清除，降低體內膽固醇水平，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。 本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，豆類植物木豆的葉子提取物能明顯降低動物的體重和血糖水平。木豆葉總提取物中主要包含芪類成分和黃酮類成分，可用于治療婦女更年期綜合癥、防治骨質疏松、降低血糖。但是，關于木豆葉提取物調

3、節(jié)膽固醇代謝的研究目前還沒有報道。本課題在國內外首次以木豆葉提取物為干預藥物，觀察芪類成分及其合成類似物S03、黃酮類成分調節(jié)體內膽固醇代謝，促進RCT過程的機理，并探討它們抗動脈粥樣硬化形成的潛在作用。 1.木豆葉提取物及其合成類似物S03對高脂血癥模型動物血脂代謝的影響 首先通過手術去除動物卵巢的方式建立高脂血癥模型模擬絕經后女性血脂變化，初步了解木豆葉總提取物對該模型的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)木豆葉總提取物具有降低動物血

4、脂和血糖水平的趨勢。為進一步明確木豆葉總提取物中具有調節(jié)膽固醇代謝作用的有效成分，通過喂食高脂飼料的方式建立高脂血癥動物模型，分別給予木豆葉芪類成分和黃酮類成分，觀察兩類成分調節(jié)血脂的效應和作用機理。研究結果表明黃酮類成分對于血脂代謝無明顯影響。而木豆葉芪類提取物卻具有明顯的血脂調節(jié)功能，能夠減輕動物體重，顯著降低高脂模型小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C水平，提高血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力。同時芪類成分還可

5、以明顯減少肝臟中TC和TG的蓄積。為探討芪類物質的作用機制，選擇肝臟中涉及膽固醇合成、吸收和代謝的三個關鍵蛋白-HMG-CoAR、LDL-R和CYP7A1作為觀察對象，以RT-PCR的方法檢測其表達水平。結果表明，芪類成分可以上調這三者的基因表達，通過促進LDL-C的吸收和增加膽固醇向膽汁酸轉化來降低體內膽固醇水平。 同時，在實驗中還觀察到芪類成分的合成類似物S03可以改善去卵巢高脂血癥模型動物的血脂代謝。去卵巢手術后動物體重和

6、血清膽固醇含量異常升高，S03可以明顯減輕去卵巢動物體重和肝臟重量，減少動物血清中TC含量和LDL-C含量。此外，S03還可以降低動物體內卵泡刺激素(FSH)和促黃體生成素(LH)的濃度，糾正去卵巢后的性激素分泌失調。 2.木豆葉芪類單體成分C03對膽固醇逆向轉運過程的影響 根據(jù)前一個實驗結果，選擇芪類成分中的單體成分C03作為觀察藥物，了解其對RCT過程的影響。巨噬細胞中膽固醇通過ABCA1流出是RCT過程的起始步驟。

7、同時，由巨噬細胞大量攝取氧化低密度脂蛋白轉化成的泡沫細胞，也是動脈粥樣硬化斑塊的重要組成部分。肝臟細胞中含有的LDL-R和SR-BⅠ介導了RCT過程的終止步驟。本實驗確定上述在RCT過程起始和終止階段的重要功能蛋白作為觀察對象，檢測C03對膽固醇逆向轉運過程中ABCA1、LDL-R和SR-BⅠ蛋白功能和表達的影響，以及C03抑制巨噬細胞內膽固醇蓄積，減少泡沫細胞形成的效應。 結果顯示C03可以上調巨噬細胞中ABCA1的表達，促進

8、巨噬細胞內[3H]膽固醇的流出，有助于啟動RCT過程。同時還發(fā)現(xiàn)C03可以抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的吞噬攝取，降低細胞內的總膽固醇含量和膽固醇酯含量，進而抑制泡沫細胞的形成。C03能夠顯著上調肝臟細胞中LDL-R的表達，且該作用具有劑量依賴性和時間依賴性。對于SR-BⅠ的表達，C03的作用并不明顯。研究表明C03不但可以促進RCT過程，而且具有防治動脈粥樣硬化脂質斑塊形成的功能，有益于減緩動脈粥樣硬化的病理改變。 此外，根

9、據(jù)已有的實驗結果，采用受體結合實驗來了解C03與肝臟雌激素受體的結合特性，觀察C03與雌激素受體結合的有關常數(shù)。為深入探討C03的作用機制奠定基礎。 3.木豆葉芪類成分C03及其合成類似物S03血管保護作用的初步研究 氧化損傷是血管內皮細胞損傷的重要因素之一，而內皮細胞的損傷和功能改變是動脈粥樣硬化的始動因素。本部分實驗采用過氧化氫損傷人臍靜脈血管內皮細胞株(EAhy926細胞)建立內皮細胞過氧化損傷模型，觀察C03對過

10、氧化氫損傷的拮抗作用,同時了解C03改善血管內皮細胞功能的效應。結果表明C03可以降低過氧化氫對EAhy926細胞的損傷，提高細胞的存活率。C03抗氧化、保護血管內皮細胞的作用可能是通過提高細胞內超氧化物歧化酶的活性，同時增加細胞的NO分泌量來達到的。 在動脈粥樣硬化形成過程中，動脈內皮發(fā)生損傷誘導血管平滑肌細胞增殖，參于炎癥反應和斑塊纖維帽的形成。本實驗通過將C03和S03與血管平滑肌細胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，S03能夠劑量依賴性抑制

11、血管平滑肌細胞的增殖，而C03的抑制作用相對較弱，可能具有減弱血管壁增厚的潛能。 綜上所述，本課題建立了兩種不同的高脂血癥動物模型，分別驗證了木豆葉芪類成分及其合成類似物S03改善高脂血癥的療效，并探討了芪類成分降低體內膽固醇含量的作用機理。然后通過體外細胞實驗，進一步探討芪類成分C03對膽固醇逆向轉運過程的干預效果和減緩泡沫細胞形成的作用。同時，對于C03抗氧化、保護血管內皮細胞，以及與雌激素受體的結合特性也做了一定程度的研究