內(nèi)源性一氧化氮對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是我國(guó)常見的消化道腫瘤，病死率高。研究證實(shí)胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性一氧化氮與胃癌細(xì)胞生存或凋亡有關(guān)。許多研究表明新發(fā)現(xiàn)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1(FOXO3a)在許多細(xì)胞凋亡過程中起著十分重要的作用。ROCK蛋白酶是細(xì)胞凋亡過程中的效應(yīng)分子，有研究表明乳腺癌細(xì)胞中抑制內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中有FKHRL1及ROCK蛋白酶的參與。然而一氧化氮(nitricoxide，NO)與ROCK蛋白酶及叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1

2、之間相互作用的機(jī)制還不完全清楚。本研究應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生觀察胃癌細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步探討SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 目的：探討L-NMMA對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能機(jī)制。 方法： 1.應(yīng)用硝酸酶還原法檢測(cè)不同時(shí)間(12h、24h、48h)、不同濃度(10μM、20μM、3

3、0μM、40μM、50μM)一氧化氮抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(N<'G>-Monomethyl-L-arginine，L-NMMA)處理組及對(duì)照組中SGC-7901胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀及缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)方法檢測(cè)不同時(shí)間及不同濃度L-NMMA處理組及對(duì)照組中SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡。 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)不同時(shí)間及不同濃度L-NMMA處理組及對(duì)照組中SGC-7901胃癌細(xì)胞內(nèi)FK

4、HRL1蛋白、p-FKHRL1(thr-32，ser-253)蛋白及ROCK蛋白表達(dá)。 4.應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)不同時(shí)間及不同濃度L-NMMA處理組及對(duì)照組中SGC-7901胃癌細(xì)胞中FKHRL1、p-FKHRL1(thr-32，set-253)及ROCK表達(dá)。 5.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞中FKHRL1表達(dá)，檢測(cè)L-NMMA處理組及對(duì)照組中SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡。 6

5、.應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染野生型FKHRL1-HA和突變型FKHRL1-HAT32A基因，檢測(cè)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.一氧化氮合酶抑制劑L-NMMA處理組與對(duì)照組比較，SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01)。而且SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡與L-NMMA濃度有顯著相關(guān)性(P<0.01)，與處理時(shí)間無相關(guān)性(P>0.05)。半胱天冬蛋白酶(caspase)3、6、7、8、10抑制劑Z-DEVD—

6、fmk不能阻斷SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡。 2.免疫熒光檢測(cè)顯示L-NMMA處理組SGC-7901胃癌細(xì)胞胞核中叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，p-FKHRL1(thr-32)胞漿內(nèi)也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而p-FKHRL1(ser-253)在胞漿內(nèi)表達(dá)沒有明顯變化。p-FKHRL1(thr-32)強(qiáng)陽(yáng)性組SGC-7901胃癌細(xì)胞胞漿內(nèi)ROCK蛋白也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者有相關(guān)性(P<0.01)。 3.ROCK蛋白

7、激酶特異性抑制劑γ-27632明顯抑制L-NMMA誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡(P<0.01)。磷酸肌醇化激酶(PI3K)特異性抑制劑wortmannin不能阻斷L-NMMA處理組FKHRL1(thr-32)蘇氨酸磷酸化。 4.用RNA干擾方法抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞中叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1表達(dá)，L-NMMA誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.01)。 5.轉(zhuǎn)染野生型FKHRL1基因(FKHRL1

8、-HA)，SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)，而且內(nèi)源性NO產(chǎn)生明顯減少(P<0.01)。 結(jié)論： 1.內(nèi)源性一氧化氮抑制劑L-NMMA能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，可為今后臨床應(yīng)用L-NMMA治療胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.L-NMMA誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是抑制內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生從而誘導(dǎo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHRL1的表達(dá)及FKHRL1蘇氨酸磷酸化(thr-32)，p-FKHRL1(thr-32)激活ROC