免疫抑制劑FK506對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)作用研究.pdf

1、體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)作用研究研究目的分離、擴(kuò)增和鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-deftved MesenchymalStem Cells,)；研究免疫抑制劑FK506對MSCs的體外成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)，及對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/β-磷酸三鈣復(fù)合物(MSCs/β-TCP)的體內(nèi)成骨促進(jìn)作用，探索FK506作為一個(gè)新型骨生長因子在臨床的潛在用途。 材料與方法: 第一部分 聯(lián)合利用密度梯度離心和差異貼壁法分離M

2、SCs擴(kuò)增傳代，相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD13、CD29、HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR。分別在定向誘導(dǎo)培養(yǎng)劑培養(yǎng)下向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。 第二部分 MSCs按實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)分組，(1)對照組：生長培養(yǎng)液中加入L-抗壞血酸-2-磷酸(AsAp)和β-甘油磷酸(β-GP)；(2)FK506處理組：在對照組基礎(chǔ)上加入50nmol/L FK506。分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)第4，8，12

3、，16天時(shí)行堿性磷酸酶(APase)活性，鈣含量測定和骨鈣素mRNA Northern印跡分析。 第三部分 將MSCs在低壓下載入多孔β-TCP立方塊，形成MSCs/β-TCP復(fù)合物，電鏡觀察材料與細(xì)胞結(jié)合情況和細(xì)胞生長情況；隨機(jī)分組:(1)對照組：生長培養(yǎng)液中加入和β-甘油磷酸(β-GP)；(2)FK506處理組：在對照組基礎(chǔ)上加入50nmol/L FK506。繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下，于植入4周和8周后取出

4、復(fù)合物作組織學(xué)檢查新骨生成。 結(jié)果： 第一部分 1．成功分離到原代細(xì)胞，外觀紡錘形和多角形，呈極性排列，集落呈漩渦狀。細(xì)胞傳代后保持成纖維細(xì)胞樣外觀。群體倍增時(shí)間約為26 h。P1、P4、P10細(xì)胞增殖速率無明顯差異。 2．流式細(xì)胞儀檢測，所分離的細(xì)胞均-地表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD13、CD29，HLA-2，而造血系細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45和HLA-DR陰性。 3．多向分化研究證實(shí)，所

5、獲得的細(xì)胞能成功向成骨細(xì)胞分化，堿性磷酸酶鈣鈷法染色、鈣茜素紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化陽性；能成功向軟骨細(xì)胞分化，Alcian藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化陽性；能成功向脂肪細(xì)胞分化，油紅O染色陽性。 第二部分 1． FK506處理組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性在培養(yǎng)第4，8，12，16天時(shí)均明顯高于對照組；而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，F(xiàn)K506處理組活性增加更明顯(培養(yǎng)第4天兩組相近，第16天時(shí)相差近10倍)。 2． FK506處

6、理組細(xì)胞的鈣含量在培養(yǎng)第8，12，16天時(shí)均明顯高于對照組；兩組培養(yǎng)物的鈣含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增加差別更加明顯。 3．培養(yǎng)第12、14、16天時(shí)提取兩組培養(yǎng)物的總mRNA行骨鈣素Northem印跡分析，對照組的骨鈣素mRNA幾乎未能測出，而FK506處理組表達(dá)明顯。 第三部分 1．電鏡顯示細(xì)胞進(jìn)入材料中心區(qū)域，貼附良好。植入4、8周后取出發(fā)現(xiàn)材料內(nèi)部細(xì)胞明顯增殖，且功能活躍。 2．組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)MSCs/β-

7、TCP復(fù)合物組新骨生成量較對照組明顯多。 結(jié)論: 1．本研究所用方法能從人骨髓中高效分離和擴(kuò)增MSCs，并從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上獲得鑒定。 2．β-TCP與MSCs生物相容性良好，F(xiàn)K506處理組植入體內(nèi)后新骨生成明顯較對照組好。 3．FK506能顯著促進(jìn)人MSCs的體外成骨細(xì)胞分化和體內(nèi)繼續(xù)成骨，提示FK506可以在骨組織工程領(lǐng)域中作為骨生長因子，用于臨床提高骨移植修復(fù)骨缺損的療效，并加深目前對免疫抑制劑作