FGF、BMP、WNT信號(hào)通道對(duì)乳鼠耳蝸神經(jīng)發(fā)育及谷氨酸鈉耳毒性作用的影響初步研究.pdf

1、第一章乳鼠耳蝸信號(hào)通道基因表達(dá) 目的:不同的信號(hào)通道(FCF、BMP、WNT等)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能有密切的關(guān)系。同時(shí)，F(xiàn)GF、BMP、WNT等對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育及存活及對(duì)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)起重要作用。目前對(duì)于信號(hào)通道在中樞神經(jīng)功能方面的研究已取得重大進(jìn)展，提示內(nèi)耳可能存在類(lèi)似機(jī)制。本部分先檢測(cè)FGF、BMP、WNT相關(guān)基因在耳蝸的表達(dá)，為進(jìn)一步研究提供支持。 方法:以出生一天(P1)的BALB/C乳鼠為研究對(duì)象，無(wú)菌條件下取出

2、耳蝸，于低血清DMEM/F-12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)(每組20個(gè))。設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用Trizol一步法抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，并以測(cè)序證實(shí)。 結(jié)果:本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各實(shí)驗(yàn)組Nudt6、Bmp4、Wnt7a、six1、six4、fas、bcl-2、β-actin均在耳蝸有明顯表達(dá)，其中Nudt6是首次發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳有表達(dá)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)在乳鼠(P1)耳蝸部分信號(hào)通道及凋亡基因有表達(dá)，bFGF的反義調(diào)控基因-Nud

3、t6在內(nèi)耳表達(dá)，提示它們?cè)趦?nèi)耳發(fā)育調(diào)控中具有一定意義。 第二章信號(hào)通道與內(nèi)耳神經(jīng)發(fā)育初步研究 目的:在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不同信號(hào)通道對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育、分化起著重要作用。但是對(duì)內(nèi)耳神經(jīng)系統(tǒng)的作用還存在爭(zhēng)議。在體外阻斷耳蝸的BMP，WNT信號(hào)途徑，觀(guān)察其對(duì)耳蝸神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的影響及形態(tài)變化，為進(jìn)一步理解這些基因的功能和下一步研究提供基礎(chǔ)。 方法:在離體耳蝸(每組20個(gè))，以Noggin阻斷BMP，以Wif-1阻斷WNT

4、信號(hào)通道，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加bFGF蛋白。離體耳蝸經(jīng)短程培養(yǎng)后，抽提RNA，并行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)。耳蝸組織行TUNEL檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。 結(jié)果:在試驗(yàn)組耳蝸出現(xiàn)sixl(3.3061±0.1454)，six4(6.6179±0.5069)，bcl-2(3.8766±0.3112)基因表達(dá)增高，Nudt6(0.4672±0.0430)表達(dá)下調(diào)，但耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著改變。 結(jié)論:阻斷BMP、WNT途徑并以bF

5、GF處理后，在耳蝸誘導(dǎo)Six1，six4，bcl-2產(chǎn)生，Nudt6表達(dá)水平下降，fas表達(dá)無(wú)明顯改變，提示信號(hào)通道被改變后凋亡被抑制，表現(xiàn)出促進(jìn)耳蝸螺旋神經(jīng)元發(fā)育的趨勢(shì)。 第三章信號(hào)通道對(duì)谷氨酸鈉耳毒性作用的影響初步研究 目的:谷氨酸鈉是神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的調(diào)節(jié)因子，過(guò)量谷氨酸鈉對(duì)內(nèi)耳神經(jīng)元有明顯毒性作用，但是在這個(gè)過(guò)程中各個(gè)信號(hào)通道是否發(fā)揮作用，如何發(fā)揮作用有待研究。本研究將谷氨酸鈉在體外作用于耳蝸，再阻斷信號(hào)通道，以

6、定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、組織化學(xué)方法檢測(cè)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)指標(biāo)。 方法:以谷氨酸鈉(200 u M)處理培養(yǎng)離體耳蝸組織，分別加入Noggin(5ug/ml)，Wif-1(2ug/ml)及bFGF(10ng/ml)。抽提RNA并行定量PCR檢測(cè)，耳蝸組織行TUNEL檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。 結(jié)果:谷氨酸鈉處理后fas表達(dá)(76.0933±7.2652)明顯高于bcl-2(9.6117±1.5023)，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡增加，Nudt6(